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逍遥散干预慢性温和性不可预知应激大鼠盲肠菌群及组织研究

作　者: 刘伟
导　师: 秦雪梅
学　校: 山西大学
专　业: 生药学
关键词: 抑郁症肠道菌群逍遥散炎症应答基因表达盲肠 GC-MS
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

抑郁症是一种常见的精神障碍性疾病,临床表现复杂,但由于其发病诱因较多,发病机理还未得到明确的阐释。流行病学调查揭示,抑郁症患者不仅表现出心理障碍,多数还伴有肠易激综合症和功能性消化不良等胃肠功能障碍,然而,现有基于神经递质的理论假说并不能够解释这种现象。为阐明抑郁症的发病机理,寻找新思路和新方法成为迫切需要解决的问题。而作为机体重要的环境因子,肠道菌群在胃肠功能方面发挥着重要作用,已成为国际上研究疾病的新热点。因此,本论文从肠道菌群的角度探讨其与抑郁症发生的关系。本论文重点围绕抑郁状态下的肠道菌群开展以下研究：①通过慢性温和性不可预知应激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)结合孤养的方法,建立CUMS抑郁模型,并采用体重、行为学指标、糖水偏爱率等参数,评价模型是否复制成功；②通过优化肠道菌群样品前处理方法、基因组DNA提取方法和ERIC-PCR扩增条件,建立适于分析肠道菌群的ERIC-PCR方法,比较肠道不同部位的菌群多态性,筛选合适的研究部位,并分析CUMS抑郁模型及药物干预后该部位菌群结构是否发生改变；③通过优化16S rDNA PCR扩增条件,建立适于分析上述部位菌群的PCR-DGGE指纹图谱,回收CUMS抑郁模型及药物干预后有差异的条带,通过序列测定技术和数据库比对,寻找并鉴定引起差异的菌种；④采用常规石蜡法和RT-PCR技术,分析CUMS抑郁模型及药物干预后肠组织形态学特征及炎症应答；⑤采用GC-MS技术,比较CUMS抑郁模型及药物干预后肠组织化学成分的变化。结果表明：①与正常对照组相比,模型组大鼠体重显著降低、行为学数据显著改变以及糖水偏爱率显著降低,说明CUMS抑郁模型成功复制；且逍遥散和盐酸氟西汀具有显著的抗抑郁效果。此外,模型组大鼠盲肠还观察到非正常的表现,如重量增加、盲肠指数升高等,而逍遥散干预能够纠正这些表现。②发现盲肠菌群多态性最显著,可作为研究部位；分析ERIC-PCR指纹图谱发现,与正常对照组相比,模型组的ERIC-PCR指纹图谱发生显著改变,给药组则有明显恢复；③与正常对照组相比,模型组的PCR-DGGE旨纹图谱有明显改变,但给药组表现出不同的变化趋势,测序结果表明Lachnospiraceae bacterium、Lactobacillus animali、Burkholderiales bacterium和Lactobacillus reuteri改变最为明显。④正常对照组盲肠无明显异常改变。模型组盲肠组织有所改变,但无明显可见的炎性细胞浸润。给药组均有不同程度的改善。⑤与正常对照组相比,与炎症相关各基因在模型组均表达上调；逍遥散和盐酸氟西汀干预后,各基因均有不同程度的表达下调。⑥与正常对照组相比,模型组盲肠组织的化学成分发生显著改变,但给药组则表现出不同的变化特点,没有显著的回调趋势。综上所述,本文建立了适于分析抑郁动物肠道菌群的ERIC-PCR和PCR-DGGE方法,发现慢性温和性不可预知应激能够引起机体肠道菌群及肠道组织形态、组织化学及与炎症相关基因表达发生明显改变,其中盲肠变化最为显著。逍遥散和盐酸氟西汀具有调整肠道菌群失调的作用,而且逍遥散在预防炎症应答方面具有一定的优势,但对组织化学成分的影响还需进一步探索。此外,还初步发现在抑郁症发病过程中盲肠可能起到预防器官的作用。因此,除组织化学以外的其他指标的变化基本可以作为判断抑郁症发生的辅助信息参考。

全文目录

中文摘要  14-16
ABSTRACT  16-18
第一章文献综述  18-27
  1.1 抑郁症及其发病机理  18-20
    1.1.1 中医对抑郁症病因病机的研究  18-19
    1.1.2 西医对抑郁症病因病机的研究  19-20
  1.2 应激与抑郁症及相关动物模型  20-22
    1.2.1 应激与抑郁  20-21
    1.2.2 与应激相关的抑郁动物模型  21-22
  1.3 肠道菌群、肠组织与抑郁症  22-25
    1.3.1 肠道菌群概述  22-23
    1.3.2 肠道菌群的生理功能  23
    1.3.3 肠道菌群与应激  23-24
    1.3.4 肠组织与抑郁症  24-25
  1.4 逍遥散及其抗抑郁机理  25-27
    1.4.1 逍遥散治疗抑郁症临床研究概况  25
    1.4.2 逍遥散抗抑郁作用及其作用机制研究概况  25-27
第二章引言  27-30
  2.1 选题的目的与意义  27
  2.2 本文的主要研究思路、内容及创新点  27-30
    2.2.1 主要研究思路  28
    2.2.2 主要技术路线图  28
    2.2.3 主要研究内容  28-29
    2.2.4 主要创新点  29-30
第三章抑郁动物模型复制、药物干预及材料收集  30-37
  3.1 引言  30
  3.2 材料与仪器  30
    3.2.1 仪器  30
    3.2.2 试剂与药材  30
  3.3 方法  30-33
    3.3.1 逍遥散复方的制备  30
    3.3.2 动物、分组及给药  30-31
    3.3.3 CUMS模型的复制  31-32
    3.3.4 检测指标  32
    3.3.5 样品的收集与保存  32-33
    3.3.6 统计分析  33
  3.4 结果  33-35
    3.4.1 CUMS对大鼠体重、行为学结果的影响  33-34
    3.4.2 逍遥散干预对CUMS模型大鼠体重和行为学的影响  34-35
    3.4.3 CUMS对大鼠盲肠的影响及逍遥散对盲肠的调节作用  35
  3.5 结论与讨论  35-37
第四章大鼠不同部位肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱研究  37-47
  4.1 引言  37
  4.2 材料与仪器  37-38
    4.2.1 仪器  37
    4.2.2 试剂  37
    4.2.3 溶液的配制  37-38
  4.3 方法  38-39
    4.3.1 样品的前处理  38
    4.3.2 基因组DNA的提取  38-39
    4.3.3 ERIC-PCR扩增  39
    4.3.4 琼脂糖电泳  39
    4.3.5 ERIC-PCR指纹图谱分析  39
    4.3.6 统计分析  39
  4.4 结果  39-45
    4.4.1 样品前处理条件的优化  39-40
    4.4.2 基因组DNA最佳提取条件的筛选  40
    4.4.3 ERIC-PCR最佳反应体系的建立  40-41
    4.4.4 不同部位肠道菌群结构特征分析  41
    4.4.5 正常对照组、模型组和逍遥散组盲肠菌群ERIC-PCR指纹图谱的构建  41-43
    4.4.6 正常对照组、模型组和盐酸氟西汀组盲肠菌群ERIC-PCR指纹图谱的构建  43-45
    4.4.7 Shannon-Wiener指数(多样性指数,H’)分析  45
  4.5 结论与讨论  45-47
第五章大鼠盲肠菌群16S rRNA PCR-DGGE指纹图谱研究  47-54
  5.1 引言  47
  5.2 材料与仪器  47-48
    5.2.1 仪器  47
    5.2.2 试剂  47
    5.2.3 溶液的配制  47-48
    5.2.4 菌株  48
  5.3 方法  48-50
    5.3.1 样品的前处理  48
    5.3.2 基因组DNA的提取  48
    5.3.3 16S rDNA V3可变区PCR扩增  48
    5.3.4 变性梯度凝胶电泳  48-49
    5.3.5 DGGE凝胶条带的回收  49
    5.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  49
    5.3.7 PCR扩增产物与T载体的连接和转化  49
    5.3.8 序列测定与分析  49-50
  5.4 结果  50-52
    5.4.1 16S rDNA V3可变区PCR扩增最佳反应体系的建立  50
    5.4.2 正常对照组、模型组和逍遥散组盲肠菌群DGGE指纹图谱的构建  50-51
    5.4.3 正常对照组、模型组和盐酸氟西汀组盲肠菌群DGGE指纹图谱的构建  51
    5.4.4 DGGE凝胶条带最佳回收方法的优化  51-52
    5.4.5 引起差异的菌群鉴定  52
  5.5 结论与讨论  52-54
第六章大鼠盲肠组织形态学和炎症应答相关基因表达研究  54-63
  6.1 引言  54
  6.2 材料与仪器  54-55
    6.2.1 仪器  54
    6.2.2 试剂  54-55
  6.3 方法  55-56
    6.3.1 盲肠组织切片制备与染色  55
    6.3.2 总RNA的提取  55
    6.3.3 cDNA第一链的合成  55
    6.3.4 RT-PCR扩增  55-56
    6.3.5 琼脂糖凝胶电泳  56
    6.3.6 数据分析  56
  6.4 结果  56-61
    6.4.1 盲肠组织形态学观察  56-57
    6.4.2 总RNA的提取  57
    6.4.3 内参基因的筛选  57-58
    6.4.4 正常对照组与模型组基因表达特征分析  58-60
    6.4.5 给药组基因表达特征分析  60-61
  6.5 结论与讨论  61-63
第七章大鼠盲肠组织化学成分研究  63-71
  7.1 引言  63
  7.2 材料与仪器  63-64
    7.2.1 仪器  63
    7.2.2 试剂  63
    7.2.3 溶液的配制  63-64
  7.3 方法  64
    7.3.1 样品制备  64
    7.3.2 GC-MS条件  64
    7.3.3 多元统计分析  64
    7.3.4 结构指认  64
  7.4 结果  64-69
    7.4.1 样品制备方法的优化  64-65
    7.4.2 常对照组与模型组大鼠盲肠典型总离子流色谱图  65-66
    7.4.3 常对照组与模型组多元统计分析  66-67
    7.4.4 给药组大鼠盲肠典型总离子流色谱图  67
    7.4.5 给药组多元统计分析  67-68
    7.4.6 逍遥散组和模型组多元统计分析  68-69
    7.4.7 盐酸氟西汀组和模型组多元统计分析  69
  7.5 结论与讨论  69-71
第八章总结与展望  71-73
  8.1 总结  71-72
  8.2 展望  72-73
参考文献  73-85
攻读学位期间取得的研究成果  85-86
致谢  86-87
个人简况及联系方式  87-89

逍遥散干预慢性温和性不可预知应激大鼠盲肠菌群及组织研究

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