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坦布苏病毒的分离鉴定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

作　者: 于春梅
导　师: 刁有祥
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 坦布苏病毒分离鉴定相对荧光定量PCR 雏鸭蛋鸡
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

坦布苏病毒感染是由坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）引起的一种以蛋鸭产蛋量下降和雏鸭神经症状为主要特征的传染性疾病。主要表现为发生迅速、流行范围广、传播速度快、发病率和死亡率都较高，严重威胁我国养鸭业的发展，加强该病的研究对保护和促进我国养鸭业的发展具有重要意义。TMUV感染于2010年由曹贞贞、张大丙首次报道，之后在我国的大部分养鸭地区流行。建立精确、快速的检测方法是控制TMUV的有效措施。本研究从发病雏鸭脑内分离到一株TMUV，并对该病毒的生物学特性进行了研究；建立了荧光定量PCR的检测方法，利用建立的方法对雏鸭和蛋鸡不同组织器官中的TMUV分布情况进行了检测，从而为TMUV致病机理的研究提供理论依据一、坦布苏病毒SDLZ株的分离鉴定通过鸭胚尿囊腔接种，从疑似TMUV感染的病料组织中分离得到一株病毒，通过RT-PCR方法和动物回归试验对分离株进行鉴定，并对该毒株的培养特性进行了研究。分离毒株RT-PCR鉴定结果显示，PCR产物与设计引物预期产物大小一致，克隆测序结果与GenBank中的TMUV相应片段的核苷酸同源性均为100%。分离毒株人工感染雏鸭后的症状及病理变化与自然感染的病例相同；鸭胚半数致死量DELD50为10^-4.5/0.2mL；该毒株可在鸡胚、鸭胚、鸭胚成纤维细胞（DEF）、非洲緑猴细胞（Vero）中培养增殖，并引起胚体和细胞病变。上述结果表明，分离毒株为TMUV，命名为SDLZ株。二、坦布苏病毒荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用根据本实验室测定的一株TMUV全基因序列（SDLZ株），选择该序列的E基因和NS5基因作为病毒蛋白基因，分别在其保守区域设计并合成特异性引物，扩增长度为225bp和264bp的目的片段。以β-actin肌动蛋白基因为内参基因，扩增长度为139bp的目的片段。将PCR扩增的的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒，经筛选、鉴定纯化后，倍比稀释作为标准品，用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建，建立检测坦布苏病毒的相对荧光定量RT-PCR方法。研究结果表明，构建的荧光定量PCR检测方法检测10倍梯度稀释的β-actin、NS5和E质粒标准品，最小检出模板浓度约为10Copies/μL，E基因、NS5基因和β-actin基因的Ct值与阳性质粒标准品的浓度均成良好的线性关系，标准曲线线性关系R²值均在0.99以上；特异性结果表明，E基因、NS5基因和β-actin基因的熔解曲线单一，表明扩增产物单一，无非特异性产物和引物二聚体；重复性结果显示，E基因、NS5基因和β-actin基因的批内、批间变异系数均小于0.5%。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法快速、稳定、特异性强、灵敏度高，可以用于TMUV早期检测，以便于早发现，以及时采取相应的防治措施，减少TMUV感染对养鸭业造成的危害。三、坦布苏病毒在雏鸭体内的动态分布规律将纯化的TMUV人工感染3日龄雏鸭，定期剖杀攻毒组和对照组雏鸭，用建立的荧光定量PCR方法对各组织病料进行检测。结果显示：试验组雏鸭人工感染3d后可在各个组织中检测到TMUV，感染后7d在各组织中的相对表达量达到最大，感染15d天仍能在各组织中检测到病毒。TMUV相对表达量最高的器官为胰脏、脑、心脏，相对表达量在0.5～0.8之间，表明这些器官是TMUV感染后的主要靶器官。其次为肝脏、脾脏，相对表达量在0.4～0.6之间。表达量较低的为法氏囊和肺脏，相对表达量在0.2～0.4之间四、坦布苏病毒在蛋鸡体内的分布规律应用建立的荧光定量PCR方法检测TMUV感染产蛋鸡不同组织在不同时间段TMUV的相对表达量的变化，结果显示：攻毒后3d在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰脏、卵泡、输卵管中均可检测到坦布苏病毒，各组织TMUV的相对表达量都较高，其中卵泡和输卵管最高；攻毒后5d肝脏、脾脏、肺脏、胰脏的病毒含量减少，卵泡和输卵管含量没有变化；攻毒后9d，只在卵泡中检测到病毒。坦布苏病毒相对表达量最高的的器官为卵泡和输卵管，其次为心脏、肝脏、脾脏，肺脏和胰脏的相对表达量最低。结果表明，坦布苏病毒虽然没有对蛋鸡造成明显的临床症状和病理变化，但是在产蛋鸡体内各组织器官均检测到了坦布苏病毒的存在，说明坦布苏病毒能够感染蛋鸡且在产蛋鸡体内存活并增殖。

全文目录

符号说明  4-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-14
1 前言  14-33
  1.1 坦布苏病毒的一般生物学特性  14-16
    1.1.1 分类学地位与形态学  14-15
    1.1.2 理化特性  15
    1.1.3 培养特性  15-16
    1.1.4 主要症状  16
    1.1.5 主要病理变化  16
  1.2 坦布苏病毒的流行病学研究  16-17
  1.3 坦布苏病毒的分子生物学研究  17-22
    1.3.1 坦布苏病毒与其他黄病毒属病毒的基因组同源性比较  17-20
    1.3.2 黄病毒属病毒主要蛋白研究进展  20-22
  1.4 坦布苏病毒诊断方法的研究进展  22-25
    1.4.1 坦布苏病毒的分离与鉴定  22
    1.4.2 坦布苏病毒血清学检测方法  22-23
    1.4.3 坦布苏病毒分子生物学检测技术  23-25
  1.5 荧光定量检测方法的研究进展  25-32
    1.5.1 实时荧光定量 RT-PCR 的定量原理  25-26
    1.5.2 实时荧光定量 PCR 的基本概念  26-27
    1.5.3 实时荧光定量的探针种类及工作原理  27-30
    1.5.4 实时荧光定量的定量方法  30-31
    1.5.5 实时荧光定量检测方法在畜牧生产中的应用  31-32
  1.6 本研究的目的及意义  32-33
2 材料与方法  33-45
  2.1 材料  33
    2.1.1 病料与试验动物  33
    2.1.2 主要试剂  33
    2.1.3 主要仪器  33
  2.2 方法  33-45
    2.2.1 主要溶剂的配置  33-35
    2.2.2 坦布苏病毒的分离鉴定  35-40
    2.2.3 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 检测坦布苏病毒 NS5 和 E 基因方法的建立  40-43
    2.2.4 坦布苏病毒在雏鸭各组织中的分布情况  43-44
    2.2.5 坦布苏病毒在蛋鸡各组织中的分布情况  44-45
3 结果与分析  45-63
  3.1 坦布苏病毒分离鉴定结果  45-51
    3.1.1 坦布苏病毒 NS3 基因 RT-PCR 扩增结果  45
    3.1.2 TMUV NS3 基因的克隆测序及序列分析  45-47
    3.1.3 坦布苏病毒的培养特性  47-48
    3.1.4 坦布苏病毒 SDLZ 株的毒力测定  48-49
    3.1.5 动物回归试验  49-50
    3.1.6 雏鸭人工感染 TMUV 后的病理组织学研究  50-51
  3.2 坦布苏病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用  51-57
    3.2.1 重组质粒的 PCR 鉴定及其测序鉴定  51
    3.2.2 荧光定量 PCR 反应条件的优化  51-52
    3.2.3 荧光定量 PCR 检测β-actin、NS5、E 基因标准曲线的建立  52-53
    3.2.4 特异性试验结果  53-54
    3.2.5 敏感性试验结果  54-55
    3.2.6 重复性试验结果  55-56
    3.2.7 临床样品检测  56-57
  3.3 雏鸭各组织中坦布苏病毒表达水平的相对荧光定量 PCR 分析  57-61
    3.3.1 攻毒后雏鸭的主要临床症状和剖检病变  57-58
    3.3.2 荧光定量 RT-PCR 方法检测 TMUV 在感染雏鸭体内的分布情况  58-60
    3.3.3 荧光定量 PCR 方法与地高辛探针检测方法的比较  60-61
  3.4 蛋鸡各组织中坦布苏病毒表达水平的相对荧光定量 PCR 分析  61-63
    3.4.1 荧光定量 RT-PCR 方法检测 TMUV 在感染蛋鸡体内的分布情况  61
    3.4.2 荧光定量 PCR 方法与地高辛探针检测方法的比较  61-63
4 讨论  63-67
5 结论  67-68
参考文献  68-80
致谢  80-81
攻读学位期间发表论文情况期间  81

坦布苏病毒的分离鉴定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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