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鸭坦布苏病毒分离鉴定及其生物学特性的研究

作　者: 颜丕熙
导　师: 李泽君
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭坦布苏病毒奉贤2010（FX2010）株分离鉴定生物学特性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 365次
引　用: 3次
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内容摘要

2010年以来，中国大陆爆发了一种由未知病原引起的以雏鸭生长迟缓和死亡、蛋鸭产蛋下降为特征的传染性疫病。该病首先发现于江浙沪地区，之后迅速蔓延至中国东南部各省市，其中包括山东、北京、河北、福建、安徽、广东和广西等。即便在冬季，该疫病的传播依然相当的迅速，这给全国的养鸭业带来了巨大的威胁。流行病学调查显示对此疫病最易感的为麻鸭，感染率为100%，致死率大约为5%到30%。为了明确该病的病原，我们从奉贤发病鸭场采集发病鸭实质脏器，经0.22um滤器过滤除菌后，经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚，进行病毒分离。结果鸡胚在接种后2-6天内死亡，死亡鸡胚可见尿囊膜增厚，胚体出血、水肿，经测定该死亡鸡胚尿囊液的毒价达到10^5.5ELD50/mL。为了确定该病毒的分类学地位，病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后在电镜下观察，发现该病毒粒子具有囊膜，直径约为45-50nm。提取该病毒核酸，用不同的核酸酶消化后，发现病毒核酸可被RNase消化而不被DNase降解，表明该病毒为RNA病毒。在此基础上我们构建了cDNA文库，随机挑选阳性克隆、测序，结果获得该病毒的两个基因的序列，序列分析表明该基因序列与坦布苏病毒Mm1775株基因的同源性分别为88.3%和88.0%。病毒交叉中和实验表明该病毒与乙型脑炎病毒无交叉中和活性，但该病毒可被抗坦布苏病毒Mm1775株E蛋白的血清中和。根据国际命名规则，将该病毒命名为鸭坦布苏病毒奉贤2010株（FX2010）。研究表明，FX2010对乙醚和氯仿敏感，不具有血凝活性。FX2010可在DEF细胞上增殖，随着病毒传代增加CPE更加的明显，同时也可在Vero细胞上增殖，但不产生CPE。FX2010经鼻腔感染和肌肉感染九周龄麻鸭后，可从感染鸭的肾脏、脑、脾脏、肺脏、胰脏、气管、血液等组织脏器中分离到较高滴度的病毒，而肝脏中的病毒含量较低；对病理学观察发现感染鸭出现中度脑炎、严重肾炎、脾脏组织细胞坏死，免疫组织化学实验显示在多个组织内皆有病毒抗原存在。为了了解该病毒分子遗传信息，我们通过引物步移法获得覆盖FX2010病毒株cDNA全长的若干克隆，然后经3’和5’RACE获得该病毒3’和5’末端序列，序列拼接后显示该病毒全长含有10991个核苷酸，编码十个蛋白。利用生物信息学手段对FX2010株进行全基因组序列的分析。系统进化分析显示，该毒株与BYDV处于同一分支上，同属于坦布苏病毒。进一步预测该病毒的不同蛋白之间的剪切位点和N连接糖基化位点，结果可见该病毒不同蛋白之间剪切位点与同种属的其他病毒具有一定的保守性。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章引言  14-21
  1.1 鸭坦布苏病毒概述  14
  1.2 DTMUV 的分子生物学  14-17
    1.2.1 DTMUV 的形态结构  14-16
    1.2.2 DTMUV 在细胞内的复制  16
    1.2.3 鸭坦布苏病毒的培养特性  16-17
  1.3 DTMUV 的流行病学  17
  1.4 DTMUV 的诊断与防控  17-19
    1.4.1 临床诊断  17-18
    1.4.2 实验室诊断  18-19
  1.5 鸭坦布苏病毒的防控  19-20
  1.6 研究的目的及意义  20-21
第二章鸭坦布苏病毒的分离与鉴定  21-32
  2.1 材料  21-22
    2.1.1 标本  21
    2.1.2 细胞系与试验动物  21
    2.1.3 主要溶液及培养基的配制  21-22
    2.1.4 主要仪器设备和器材  22
  2.2 方法  22-28
    2.2.1 标本的采集及处理  22-23
    2.2.2 病原体的 SPF 鸡胚分离培养  23
    2.2.3 病毒的纯化  23
    2.2.4 病毒的鉴定及其理化性质的测定  23-24
    2.2.5 cDNA 文库的建立  24-28
  2.3 实验结果  28-31
    2.3.1 病毒分离结果  28-29
    2.3.2 病毒纯化结果  29
    2.3.3 电镜观察结果  29
    2.3.4 病毒鉴定结果  29-31
  2.4 讨论  31-32
第三章鸭坦布苏病毒生物学特性的研究  32-43
  3.1 材料  32
    3.1.1 病毒、细胞、实验动物  32
    3.1.2 主要溶液及细胞培养基的配制  32
  3.2 方法  32-36
    3.2.1 细胞培养特性  32-33
    3.2.2 血凝试验  33
    3.2.3 病毒交叉中和试验  33-34
    3.2.4. 病毒毒力测定  34-35
    3.2.5 病毒理化性质的鉴定  35
    3.2.6 动物回归试验  35-36
    3.2.7 病理组织切片观察  36
    3.2.8 免疫组织化学  36
  3.3 结果  36-41
    3.3.1 细胞培养特性  36-37
    3.3.2 血凝试验  37
    3.3.3 病毒交叉中和试验结果  37
    3.3.4 病毒毒力测定结果  37-38
    3.3.5 病毒对鸭致死率的测定结果  38
    3.3.6 病毒理化性质的鉴定结果  38
    3.3.7 动物回归试验结果  38
    3.3.8 病理切片及免疫组织化学观察结果  38-41
  3.4 讨论  41-43
第四章鸭坦布苏病毒全基因组序列测定及分析  43-57
  4.1 材料  43-44
    4.1.1 病毒株  43
    4.1.2 主要试剂和仪器  43
    4.1.3 引物设计  43-44
  4.2 方法  44-51
    4.2.0 技术路线  44-45
    4.2.1 基因组内侧序列的 RT-PCR 扩增  45-47
    4.2.2 基因组 5’末端序列的测定（5’RACE）  47-49
    4.2.3 基因组 3’末端序列的测定（3’RACE）  49-50
      4.2.3.1 引物设计  49
      4.2.3.2 3’末端 RACE  49-50
      4.2.3.3 PCR 产物的纯化、克隆与测序  50
    4.2.4 FX2010 株基因组结构的分析  50-51
    4.2.5 糖基化位点的预测  51
    4.2.6 系统进化分析  51
  4.3 结果及分析  51-55
    4.3.1 基因组内侧序列的 RT-PCR 扩增  51-52
    4.3.2 基因组 5’末端的获取  52
    4.3.3 基因组 3‘末端的获取  52
    4.3.4 FX2010 株基因组结构分析  52-54
    4.3.5 糖基化位点的预测  54
    4.3.6 系统进化分析结果  54-55
  4.4 讨论  55-57
第五章全文结论  57-58
参考文献  58-61
致谢  61-62
作者简历  62

鸭坦布苏病毒分离鉴定及其生物学特性的研究

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