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光合细菌的分离鉴定及胶状红长命菌分泌的蛋白水解酶生化性质的研究

作　者: 陶雪英
导　师: 王伟武
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 光合细菌 分离鉴定 胶状红长命菌 蛋白水解酶 生化特性
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


不产氧光合细菌(以下简称光合细菌)是地球上最古老的细菌类群之一。它们能以光作为能源在厌氧光照条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体及碳源进行光合作用。光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处,主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。由于光合细菌具有独特的生活方式,因此它在农业、环保、医药等方面均有较高的研究和应用价值。从不同来源的样品中富集分离到28株光合细菌。通过对形态、颜色,碳源、氮源利用以及16S rDNA序列的分析,将其分为5类,并选择了8株菌进行了测序,并构建了系统发育树。共分离到四种光合细菌分别为胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulate))、类球红细菌(Rhodobacter sphaerorides)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palutris)。胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)是目前发现的光合细菌中唯一能够分泌蛋白酶的菌株。本研究从分离得到的光合细菌中选取胶状红长命菌H1(Rubrivivax gelatinosus H1)作为研究对象,研究了培养条件对其胞外蛋白酶分泌的影响,并对其分泌的胞外蛋白酶的生化特性进行了初步的研究。研究发现菌株H1在黑暗好氧的培养条件下,培养液的上清液中均未能检测到胞外蛋白酶活性,说明在黑暗好氧培养下该菌株不产生胞外蛋白酶。而在厌氧光照培养条件下,在对数生长期阶段胞外蛋白酶活力随细菌快速繁殖而迅速升高。在132h时,细菌生长达到顶峰,同时蛋白酶活力也达到最大值。当进入衰亡期后,蛋白酶活力也随之下降。不同培养基成分对菌株Hl产胞外酶的研究结果显示,菌株H1分别以苹果酸为碳源时,以谷氨酰胺或氯化铵为氮源时,分泌的蛋白酶酶活最高。研究还发现,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能抑制该蛋白水解酶的活性,但其它型丝氨酸蛋白酶抑制剂、金属离子型蛋白酶抑制剂以及半胱氨酸/丝氨酸型蛋白酶抑制剂均不能抑制蛋白水解酶的活性,这表明该蛋白酶有可能是一类丝氨酸蛋白酶。蛋白酶的生化特性研究还显示,蛋白酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0；且该酶对多种有机试剂或变性剂具有较强的耐受性；多种二价金属离子对该酶的活性基本没有促进或抑制作用。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略词  11-12文献综述  12-26  1 光合细菌概况  12-16    1.1 前言  12    1.2 光合细菌的分类  12-13    1.3 光合细菌的主要生理生化特性  13-14    1.4 光合细菌的应用  14-16      1.4.1 光合细菌在水产养殖中的应用  15      1.4.2 光合细菌在有机废水处理中的应用  15-16      1.4.3 在能源开发方面的应用  16      1.4.4 在保健及医药方面的应用  16  2 蛋白水解酶研究概况  16-20    2.1 蛋白酶的分类  16-18    2.2 不同来源的蛋白水解酶及功能  18    2.3 光合细菌胞外酶的研究  18-20  参考文献  20-26第一章 光合细菌的分离鉴定  26-44  1 实验材料和方法  26-30    1.1 样品的采集  26    1.2 培养基  26-27    1.3 光合细菌的分离与鉴定  27-28      1.3.1 菌种富集分离  27      1.3.2 菌落及菌体形态观察  27      1.3.3 生理生化特征  27-28      1.3.4 生长最适初始pH的测定和pH耐受范围  28      1.3.5 光合细菌耐盐性的测定  28    1.4 细菌的16S基因序列的扩增  28-30      1.4.1 细菌的16S基因序列的扩增  28-29      1.4.2 扩增片段的限制性酶切  29      1.4.3 菌株的分子生物学水平的鉴定  29-30  2 结果与讨论  30-40    2.1 光合细菌的富集培养  30-31    2.2 菌株生理生化实验结果  31-33      2.2.1 碳源和电子供体实验  31-32      2.2.2 氮源利用实验  32-33    2.3 菌株的生长特性  33-35      2.3.1 生长最适初始pH的测定和生长pH耐受范围  33-34      2.3.2 光合细菌的耐盐能力的研究  34-35    2.4 16S rDNA的扩增和限制性酶切结果  35-36    2.5 菌株16S rDNA的序列分析  36-40  3 讨论  40-42  参考文献  42-44第二章 胶状红长命菌胞外蛋白酶的性质  44-66  1 材料和方法  44-50    1.1 供试菌株  44    1.2 试验材料与试剂  44    1.3 实验方法  44-50      1.3.1 菌株H1的生长曲线测定  45      1.3.2 粗酶液的制备  45      1.3.3 蛋白水解酶活性梯度凝胶电泳  45-46      1.3.4 蛋白酶活性的测定  46      1.3.5 培养条件对菌株H1产酶的影响  46      1.3.6 粗酶液SDS-PAGE电泳  46-47      1.3.7 不同培养基成分对菌株产胞外蛋白水解酶的影响  47      1.3.8 菌株H1产的胞外蛋白酶的生化性质研究  47-49      1.3.9 蛋白水解酶突变株的筛选  49-50  2 结果与分析  50-62    2.1 H_1菌株生长曲线的测定  50-51    2.2 蛋白质SDS-PAGE电泳  51    2.3 培养条件对菌株H1产酶量的影响  51-52    2.4 培养基成分对菌株胞外蛋白酶产量的影响  52-55      2.4.1 不同碳源培养基对菌株H1产胞外酶的影响  52-53      2.4.2 氮源对菌株H1胞外蛋白酶活力的影响  53-55    2.5 菌株H1所产的胞外蛋白水解酶的生化性质  55-61      2.5.1 最适反应pH值的测定  55      2.5.2 最适反应温度的测定  55-56      2.5.3 pH稳定性的测定  56      2.5.4 温度对酶稳定性的影响  56-58      2.5.5 蛋白酶抑制剂对胶状红长命菌分泌的蛋白酶活力的影响  58-59      2.5.6 金属离子对蛋白酶活性的影响  59-60      2.5.7 有机试剂等变性剂对蛋白酶活性的影响  60-61    2.6 利福平抗性菌株的筛选  61    2.7 转座子随机突变实验  61-62  3 讨论  62-64  参考文献  64-66全文总结  66-68附录一  68-74附录二 有关核苷酸序列  74-82致谢  82

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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