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猪CuZnSOD基因核心启动子鉴定及精子介导法制备CuZnSOD转基因肉兔的研究

作　者: 石元
导　师: 曾勇庆
学　校: 山东农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 转基因 睾丸内注射 CuZnSOD基因 启动子 猪 双荧光素酶报告基因
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


随着现代规模化养殖程度的不断提高，氧化应激在商品猪生产中的危害日益显现。铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）是一种重要的抗氧化酶，在维持生物体内氧自由基平衡方面发挥重要作用。CuZnSOD广泛分布于细胞质基质中，约占SOD总量的90%。随着生物技术的发展，许多物种的CuZnSOD基因组序列已被克隆出来。目前CuZnSOD基因的研究多集中于其功能方面，而对于表达调控机制并不清楚。为了进一步研究CuZnSOD基因的结构与功能以及验证CuZnSOD基因在提高肌肉抗氧化能力方面的功能，本研究进行了以下研究，一是PCR克隆CuZnSOD基因的启动子区，对其转录调控机制进行了探讨，二是通过制备转CuZnSOD基因肉兔模型来研究并验证CuZnSOD对肌肉抗氧化性能等肉质性状影响的重要功能和育种价值。主要研究结果如下：1.利用PCR方法从莱芜猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游853bp的片段，然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐截短的启动子系列片段，并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体（PGL3-Basic）中。瞬时转染NIH/3T3细胞，双荧光素酶报告基因检测启动子活性结果显示，-383bp～+67bp启动区活性最强，进一步通过缺失分析发现，-75bp～-32bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的核心启动子序列，其中存在多个潜在的转录因子结合位点，研究结果提示，这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。2.利用本实验室已经克隆得到的CuZnSOD基因的CDS序列，并借助于基因重组技术，成功地构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP1-CuZnSOD，又通过PCR扩增和双酶切鉴定技术，均得到大小为465bp的片段，经测序鉴定其含有完整的CuZnSOD的cDNA片段；重组载体转染NIH/3T3细胞，观察到绿色荧光蛋白表达的细胞，RT-PCR检测到目的基因的表达，说明CuZnSOD已克隆进pIRES2-AcGFP1载体中，并可顺利表达。3.将构建成功的重组质粒与Roche的X-treme GENE HP转染试剂孵育15min后，加入适当DMEM配成注射液，用1mL注射器对6只健康成年的新西兰肉公兔进行双侧睾丸注射。对照组2只注射等量生理盐水。每周注射一次，连续注射3次。第三次注射完成之后间隔一个月，按照公母比例1:6的配种方案进行配种，获得F1代个体，F1代阳性个体横交获得F2代个体。4.在转基因后代中，F1代实验组共出生169只，其中阳性个体54只，阴性个体115只，阳性率为31.95%；空白对照组共出生48只。F2代实验组共出生58只，其中阳性个体23只，阴性个体35只，阳性率为39.66%；空白组共出生29只。F1代个体在屠宰性能方面，阳性组的日增重显著性低于阴性组和空白组（P<0.05），阳性组和阴性组的全净膛率和半净膛率都显著性高于空白组（P<0.01）；F1代个体在肉品质测定方面，阳性组的滴水损失显著地低于阴性组和空白组（P<0.01）；F1代阳性个体的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性比阴性组和空白组有显著提高（P<0.05）。Western blot检测结果表明，F1代阳性兔肌肉中CuZnSOD蛋白表达量明显上调（P<0.05）。在荧光检测方面，将阳性个体和空白个体同时放在活体动物体内可见光分析仪中观察发现，阳性个体的光强度明显比空白个体的光强度要强，并且在四肢和尾部较为明显。F2代个体在屠宰性能方面，阳性组的日增重显著性低于阴性组和空白组（P<0.05），但F2代阳性组和阴性组的全净膛率和半净膛率都显著性低于空白组（P<0.05）；F2代个体在肉品质测定方面，阳性组的滴水损失显著地低于阴性组和空白组（P<0.01）；F2代阳性个体的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性比阴性组和空白组有显著提高（P<0.01）。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-21
  1.1 常规转基因动物的制备方法  13-16
    1.1.1 DNA 显微注射法  13-14
    1.1.2 逆转录病毒载体法  14
    1.1.3 胚胎干细胞介导法  14
    1.1.4 精子载体法  14-15
    1.1.5 体细胞核移植法  15
    1.1.6 RNAi  15
    1.1.7 基因打靶法  15-16
  1.2 精子载体法介导基因转移的研究进展  16-18
    1.2.1 共孵育法  16
    1.2.2 电击法  16
    1.2.3 脂质体法  16-17
    1.2.4 睾丸内注射法  17
    1.2.5 磁性纳米基因载体转染  17-18
  1.3 转基因动物技术的应用  18-20
    1.3.1 在基础理论方面的应用  18
    1.3.2 改良动物品种和生产性能  18
    1.3.3 建立医学动物模型  18-19
    1.3.4 异种器官移植  19
    1.3.5 作为动物生物反应器  19-20
  1.4 转基因存在的问题与展望  20
  1.5 CuZnSOD 基因的研究进展  20-21
  1.6 本研究的目的、意义  21
2 试验材料  21-24
  2.1 试验动物和样品采集  21-22
  2.2 主要仪器  22
  2.3 主要试剂  22-23
  2.4 主要数据库及生物软件  23
  2.5 常用试剂的配制  23-24
    2.5.1 琼脂糖凝胶电泳所用试剂  23
    2.5.2 细菌转化、阳性克隆筛选所用试剂  23
    2.5.3 蛋白分析用试剂  23-24
3 试验方法  24-39
  3.1 CuZnSOD 基因启动子克隆鉴定及分析  24-27
    3.1.1 引物设计  24
    3.1.2 猪基因组提取  24-25
    3.1.3 CuZnSOD 基因启动子的克隆  25
    3.1.4 生物信息学分析  25-26
    3.1.5 不同长度 CuZnSOD 基因启动子重组载体的构建  26
    3.1.6 细胞培养及转染  26-27
    3.1.7 双荧光素酶活性测定  27
    3.1.8 数据统计分析  27
  3.2 CuZnSOD 基因真核表达载体的构建  27-31
    3.2.1 引物设计  27
    3.2.2 CuZnSOD 基因的克隆  27
    3.2.3 目的片段的回收、纯化  27-28
    3.2.4 目的基因与真核表达载体的双酶切  28
    3.2.5 目的基因与真核表达载体连接  28
    3.2.6 重组质粒的转化  28-29
    3.2.7 重组质粒的 PCR 鉴定  29
    3.2.8 重组质粒酶切鉴定  29-31
  3.3 重组真核表达载体在小鼠胚胎细胞（NIH/3T3）中的表达  31-33
    3.3.1 NIH/3T3 细胞的培养  31
    3.3.2 脂质体法转染 NIH/3T3 细胞  31
    3.3.3 转基因细胞系 RT-PCR 的初步鉴定  31-33
  3.4 CuZnSOD 转基因肉兔模型的制备  33-39
    3.4.1 无内毒素质粒的大量提取  33
    3.4.2 重组真核表达载体的线性化处理  33-34
    3.4.3 真核表达载体的睾丸内注射  34-35
    3.4.4 仔代个体出生及相关处理  35
    3.4.5 仔兔的活体荧光检测  35
    3.4.6 仔兔的 PCR 初步检测  35-36
    3.4.7 western blot  36-37
    3.4.8 转基因兔的屠宰与肉质测定  37-38
    3.4.9 转基因兔肉质抗氧化性测定  38-39
4 结果与分析  39-50
  4.1 猪 CuZnSOD 基因启动子的克隆鉴定与分析  39-42
    4.1.1 猪 CuZnSOD 基因启动子的克隆  39
    4.1.2 猪 CuZnSOD 基因 5′端序列的生物信息学分析  39-40
    4.1.3 不同长度启动子片段的克隆  40
    4.1.4 荧光素酶表达载体的构建及酶切鉴定  40
    4.1.5 表达载体的双萤光素酶活性检测  40-41
    4.1.6 核心启动子的确立  41-42
  4.2 CuZnSOD 基因真核表达载体的构建  42-43
    4.2.1 CuZnSOD 基因的 PCR 扩增结果  42
    4.2.2 重组载体的酶切鉴定  42-43
    4.2.3 重组载体的测序鉴定  43
  4.3 重组质粒 pIRES2-AcGFP1-CuZnSOD 转染 NIH/3T3 细胞后表达结果  43-44
    4.3.1 细胞转染  43-44
    4.3.2 RT-PCR  44
  4.4 CuZnSOD 转基因兔模型的制备  44-50
    4.4.1 转基因兔的荧光蛋白表达检测  44-45
    4.4.2 转基因兔的 PCR 检测结果  45-46
    4.4.3 F1 代蛋白水平的检测  46
    4.4.4 F1 代、F2 代兔屠宰性能测定  46-47
    4.4.5 F1 代、F2 代兔肉品质测定  47-48
    4.4.6 F1 代抗氧化性测定  48-49
    4.4.7 F2 代抗氧化性测定  49-50
5 讨论  50-54
  5.1 猪 CuZnSOD 基因启动子活性分析  50-51
  5.2 制约精子载体法介导外源基因转移效率的因素  51-52
    5.2.1 外源 DNA 的含量及性质  51
    5.2.2 供体的状态及注射的方法  51
    5.2.3 脂质体包埋对转基因影响  51-52
  5.3 外源基因进入组织后的命运  52
  5.4 转基因动物的检测  52-53
  5.5 转基因对肉兔的影响  53-54
6 结论  54-55
参考文献  55-60
致谢  60-61
攻读学位期间发表论文情况  61

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