学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

水稻纹枯病菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗传转化体系的构建

作　者: 任衍春
导　师: 孙国昌
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 立枯丝核菌 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GPD) GPD启动子 农杆菌介导转化
分类号: S435.111.42
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 7次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


由立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)引起的水稻纹枯病是世界性的水稻三大病害之一,几乎所有的稻田都会发生纹枯病,全世界平均每年因该病造成的损失稻谷达数十亿公斤。因此,对水稻纹枯病菌的研究具有非常重要的科学和实际意义。由于缺乏有效的遗传转化系统,对该病的研究主要集中在病菌的分类、抗性机制、病害流行与防治等研究。关于水稻纹枯病菌的遗传转化,国外已有了一些报道,国内则报道甚少。对于立枯丝核菌的转化效率,相关报道显示也是比较低,采用合适的启动子,是能否进行高效转化的关键因素之一,因此寻找水稻纹枯病菌高效启动子是提高其转化效率的一种途径。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GPD)在真核细胞中高效表达,如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)其含量可达细胞内可溶蛋白的5%；在面包酵母中其mRNA的量占总mRNA量的2-5%。因此,GPD基因的启动子可能为一强启动子。而且在许多不同的真菌中,GPD基因启动子已经被成功地用来构建转化体系。本研究利用同源克隆及染色体步移策略,从水稻纹枯病菌基因组获得4613bp片段,NCBI序列同源分析该片段包含了GPD基因,暂命名为vsGPD,预测其全长为1531bp。通过RT-PCR扩增其CDS序列,分析显示其拥有10个内含子。Southern杂交结果显示,vsGPD在水稻纹枯病菌基因组中以单拷贝形式存在。vsGPD编码343个氨基酸的蛋白。蛋白序列同源性分析,vsGPD基因氨基酸同源性与立枯丝核菌国际标准融合群AG-3最高,达85.52%。此外,在不同融合群的立枯丝核菌中内含子的分布及大小具有高度相似性。根据vsGPD基因设计引物,扩增水稻纹枯病菌的GPD启动子通过TFSEARCH软件对GPD启动子片段进行分析,结果表明此序列含有TATA-box、CAAT-box、G-box、SP1-box及CT rich-motif等顺式作用元件。采用PlantCARE数据库及TFSitescan service软件分析GPD启动子片段,结果表明,该片段含有多个转录因子如ADR1、GATA-box、CCAAT-box、StuA-type、GCR1及GCN4等结合位点。以pCAMBIA1300X质粒为骨架,构建3个以水稻纹枯病菌GPD启动子启动潮霉素抗性基因的表达载体,其中2个载体的潮霉素基因做了如下改进,通过Over-lap PCR将潮霉素基因的5’端的160bp-195bp区间的AT转变为GC或在潮霉素基因两端添加水稻纹枯病菌的漆酶(Z54277)内含子。利用上述质粒,进行农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝体及菌丝球。最终在农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝球中,获得了转化子。然而这些转化子在继代培养中,潮霉素抗性性状,出现了丢失的现象。表型分析表明,这些转化子为非整合转化(Transient transformation)即DNA未整合至染色体上,而是游离在基因组之外,因而在生长或继代的过程中丢失。此外,转化子获得数量偏低,表明该遗传转化体系有待进一步优化。

全文目录


摘要  5-8ABSTRACT  8-11目录  11-13第一部分 文献综述  13-27  第一章 水稻纹枯病菌研究概况  13-18    1 水稻纹枯病菌  13-14    2 水稻纹枯病症状  14-15    3 水稻纹枯病菌侵染循环与防治  15    4 水稻纹枯病菌侵染水稻的过程  15-16    5 水稻纹枯病菌的致病机理  16-18  第二章 丝状真菌转化的研究进展  18-27    1 丝状真菌遗传转化研究概况  18-22      1.1 CaCl_2-PEG遗传转化方法  18-19      1.2 电激法  19-20      1.3 限制酶介导的整合技术  20      1.4 醋酸锂转化  20-21      1.5 基因枪法转化  21      1.6 根癌农杆菌介导的转化  21-22    2 丝状真菌遗传转化的启动子与筛选标记  22-26      2.1 启动子  22-24      2.2 丝状真菌遗传转化的筛选标记  24-26    3 本课题研究目的与意义  26-27第二部分 研究内容  27-61  第一章 水稻纹枯病菌GPD基因的克隆与序列分析  27-40    1 前言  27    2 材料与方法  27-31    3 结果与分析  31-38    4 讨论  38-40  第二章 水稻纹枯病菌GPD启动子的克隆  40-48    1 前言  40    2 材料与方法  40-42    3 结果与分析  42-47    4 讨论  47-48  第三章 农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化体系的建立  48-61    1 前言  48    2 材料与方法  48-53    3 结果和分析  53-59    4 讨论  59-61参考文献  61-71附录1:立枯丝核菌GPD基因的克隆与分析  71-81附录2:缓冲液配方  81-82附录3:培养基配方  82-83附录4:Trizol法提取真菌RNA  83-84附录5:大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备  84-86附录6:大肠杆菌的转化  86-87附录7:碱法提取质粒  87-88附录8:载体图  88-89附录9:农杆菌的冻融法转化  89-90攻读学位期间取得的研究成果  90-91致谢  91-92

相似论文

  1. 一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析,S435.654
  2. 灵芝真菌免疫调节蛋白基因在虫草真菌中的表达与特性分析,S567.35
  3. 水稻OsELF3基因RNAi载体的构建及其转化研究,S511
  4. PKR基因表达载体构建及农杆菌介导玉米茎尖遗传转化,S513
  5. PEG介导的玉米丝轴黑粉菌原生质体转化与ras、gpd启动子的克隆,S435.131
  6. 贵州省半夏病害种类调查及立枯病防治技术研究,S435.672
  7. 土壤细菌对大豆根腐病主要病原菌抑制作用的研究,S435.651
  8. 杨树遗传转化及超声波处理对插穗生根影响的研究,S792.11
  9. 农杆菌介导人胰岛素基因BCA转化银耳研究,S567.34
  10. 根癌农杆菌介导深绿木霉（Trichoderma atroviride）T23转化体系的建立以及高效降解敌敌畏突变株筛选与应用研究,S481.8
  11. 产几丁质酶木霉的诱变选育及对玉米纹枯病的生物防治,S435.131
  12. 盾壳霉产孢相关基因的克隆及腺苷脱氨酶(CMADA)基因的初步研究,S476.1
  13. 玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆表达及致病性分析,S435.131
  14. 不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物,S567.34
  15. 根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化的研究,Q78
  16. 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化及脂肪酶基因表达的研究,Q78
  17. 马铃薯黑痣病菌菌丝融合群鉴定及其致病力的测定,S435.32
  18. 农杆菌介导的高羊茅转化WAX2基因研究,S688.4
  19. 棉花GhManA2基因纤维特异表达启动子的克隆与功能初步分析,S562
  20. 北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性评价及GFP基因在病理学研究中的应用,S435.13

中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻纹枯病
© 2012 www.xueweilunwen.com