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棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2启动子活性分析

作　者: 严宇澄
导　师: 吴益东
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 棉铃虫 P450 5’-调控区 启动子 双荧光素酶报告基因系统 多态性
分类号: S435.622
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


棉铃虫Helicoverpa armigera (Hubner)是一种世界性的重要经济害虫,其发生和危害严重影响到棉花的产量和质量。由于长期采用化学防治,棉铃虫对多种化学药剂尤其是拟除虫菊酯类杀虫剂产生了严重的抗性。细胞色素P450基因的过量表达导致解毒代谢增强是棉铃虫对拟除虫菊酯产生抗性的主要机理。属于CYP9和CYP6家族的多个P450基因的过量表达已被证实与棉铃虫对杀虫剂的解毒代谢有关。本文对棉铃虫P450基因CYP9A12, CYP9A17v2的5’-调控区进行了扩增,并采用报告基因技术对CYP9A17v2核心启动子区进行了缺失分析,以期找出其过量表达的调控机理,同时对CYP9家族基因(CYP9A12, CYP9A14, CYP9A17v2)和CYP6家族基因(CYP6B7)的编码区cDNA多态性进行了分析。1.棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A12和CYP9A17v2 5’-调控区克隆和序列分析细胞色素P450基因CYP9A12和CYP9A17v2的过量表达和棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关。以YG和YGF品系基因组DNA为模板,经PCR扩增和测序,获得CYP9A12 5 ’-调控区序列约2.6kb, CYP9A17v2 5’-调控区序列约3.4kb。通过BDGP在线分析软件预测出各基因的转录起始位点,并利用日本京都大学KEGG序列数据库MOTIF检索分析服务系统预测出上游启动子区域内两个基因的转录因子结合位点。通过对棉铃虫抗性和对照品系中这两个基因5’-调控区的克隆和序列分析,为下一步研究棉铃虫P450基因表达调控机制奠定了重要基础。2.棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2核心启动子区缺失分析CYP9A17v2的过量表达与棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为了研究CYP9A17v2表达调控机制,对CYP9A17v2核心启动子区域的功能进行了分析。构建了含荧光素酶报告基因(1uc)和CYP9A17v2启动子不同长度缺失片段(-1095-+43)的重组质粒,转染sf9细胞瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。功能分析的结果表明：所有构建的7个缺失片段均具有启动子活性,-197-+43启动子区域的转录活性最高。在CYP9A17v2基因5’-调控区-19～-113区域内可能存在转录增强因子的结合位点,而在-1095～-197区域内可能存在转录抑制因子的结合位点。本研究为探索棉铃虫CYP9A17v2过量表达的转录调控机理奠定了重要基础。3.棉铃虫拟除虫菊酯抗性相关细胞色素P450基因多态性分析CYP9家族基因(CYP9A12、CYP9A14、CYP9A17v2)和CYP6家族基因(CYP6B7)均与棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关。本研究对棉铃虫拟除虫菊酯抗性品系YGF、抗性对照品系YG、敏感品系SCD、田间品系GY中这四个基因的全长cDNA序列进行了克隆和比较。其开放阅读框均存在单核苷酸多态性位点,导致多个位点的氨基酸替换,在P450较为保守的血红素结合区和螺旋K保守区等区域也发现存在氨基酸替换。研究还发现了一些抗性品系中特有的氨基酸替换。通过检测分析这4个基因在不同品系间的氨基酸多态性位点,筛选出比较有意义的位点,为下一步进行抗性相关的功能表达研究奠定基础。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11第一章 文献综述  11-31  1. 棉铃虫对拟除虫菊酯抗性  11-14    1.1 棉铃虫对拟除虫菊酯抗性的发生概况  11-12    1.2 棉铃虫对拟除虫菊酯的抗性机理  12-14      1.2.1 表皮穿透速率降低  12-13      1.2.2 神经敏感性下降  13      1.2.3 解毒代谢作用增强  13-14  2. 细胞色素P450概况  14-18    2.1 细胞色素P450的命名  14-15    2.2 细胞色素P450的结构特征  15    2.3 细胞色素P450的多样性  15-16    2.4 细胞色素P450的遗传多态性  16-17    2.5 细胞色素P450介导的昆虫抗药性机制  17-18  3 昆虫细胞色素P450基因表达调控机制  18-26    3.1 真核生物基因表达调控概述  18    3.2 基因转录水平的顺式作用元件  18-21      3.2.1 核心启动子(Basal promoter)  19      3.2.2 启动子上游序列(Upstream promoter)  19      3.2.3 增强子(Enhancers)  19-20      3.2.4 绝缘子(Insulator)  20      3.2.5 时序与组织特异性调控序列(Tempor-control and tissue-specific regulatorysequence)  20      3.2.6 性别控制与同源异型盒(Sex-determination and the homebox)  20      3.2.7 反应元件(response elements)  20-21    3.3 基因转录水平调控的反式作用因子  21-22    3.4 昆虫细胞色素P450基因的表达调控机制  22-26      3.4.1 昆虫细胞色素P450基因的表达规律  22      3.4.2 昆虫细胞色素P450基因的表达调控机制  22-23      3.4.3 顺式元件调控  23-24      3.4.4 反式作用因子调节  24-25      3.4.5 顺式作用元件和反式作用因子共同调控  25-26      3.4.6 转录后调控  26  4. 荧光素酶报告基因技术  26-31    4.1 双荧光素酶报告基因检测系统  27-28    4.2 荧光素酶报告基因应用研究进展  28-31      4.2.1 基因表达研究  28      4.2.2 蛋白质间相互作用研究  28      4.2.3 毒性物质检测研究  28-29      4.2.4 RNA干扰研究  29-31第二章 棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A12和CYP9A17v25’-调控区的克隆和序列分析  31-43  1. 材料和方法  32-35    1.1 供试昆虫  32    1.2 主要试剂和仪器  32    1.3 棉铃虫YG、YGF品系DNA的提取  32-33    1.4 引物设计及CYP9A12和CYP9A17v25’-调控区的PCR扩增、克隆和测序  33-35      1.4.1 PCR产物回收和纯化  33-34      1.4.2 质粒载体的连接反应  34      1.4.3 转化感受态细胞  34-35      1.4.4 细菌扩大培养  35      1.4.5 目标片段检测  35  2 结果和分析  35-40    2.1 目标片段的获得  35    2.2 P450基因CYP9A12和CYP9A17v25’-调控区序列分析  35-40  3. 讨论  40-43第三章 棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2核心启动子区缺失分析  43-55  1 材料与方法  44-49    1.1 供试昆虫  44    1.2 主要试剂和仪器  44    1.3 CYP9A17v2基因系列缺失质粒的构建  44-47      1.3.1 DNA提取  44      1.3.2 CYP9A17v2基因系列缺失片段PCR扩增及产物纯化  44-45      1.3.3 CYP9A17v2基因系列缺失片段与载体的连接、转化、筛选阳性克隆测序  45      1.3.4 CYP9A17v2基因系列缺失质粒提取及酶切、测序检测  45-47    1.4 草地贪夜蛾sf9细胞培养  47-48      1.4.1 Grace's培养基的配制  47      1.4.2 细胞的复苏和传代  47      1.4.3 sf9细胞的冻存  47-48      1.4.4 血细胞计数板计数  48      1.4.5 sf9细胞的培养  48    1.5 真核细胞转染实验  48    1.6 双荧光素酶活性检测  48-49    1.7 生物信息学分析  49  2. 结果与分析  49-52    2.1 含CYP9A17v2基因5’-调控区系列缺失片段重组质粒的构建及鉴定  49-50    2.2 各转染质粒浓度及纯度检测结果  50-51    2.3 CYP9A17v2基因5’调控区系列缺失片段的转录活性  51-52    2.4 CYP9A17v2基因5’-调控区转录因子结合位点的预测  52  3. 讨论  52-55第四章 棉铃虫拟除虫菊酯抗性相关细胞色素P450基因多态性分析  55-67  1. 材料和方法  56-58    1.1 供试昆虫  56    1.2 主要仪器和试剂  56    1.3 总RNA提取及cDNA第一链合成  56-57      1.3.1 棉铃虫总RNA提取  56-57      1.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA  57      1.3.3 cDNA第一链合成  57    1.4 PCR扩增及产物的纯化、克隆与测序  57-58  2. 结果和分析  58-64    2.1 目标片段的获得  58    2.2 细胞色素P450基因CYP6B7多态性分析  58-60    2.3 细胞色素P450基因CYP9A14多态性分析  60-61    2.4 细胞色素P450基因CYP9A12多态性分析  61-63    2.5 细胞色素P450基因CYP9A17v2多态性分析  63-64  3. 讨论  64-67全文总结  67-69参考文献  69-79附录:发表的学术论文  79-81致谢  81

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 纤维作物病虫害 > 棉病虫害 > 虫害
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