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牛源ETEC基因组差异基因的筛选与分析

作　者: 张洋龙
导　师: 倪宏波
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 大肠杆菌耐药基因抑制性消减杂交基因文库
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

牛源产肠毒素大肠杆菌是一类能够大规模引起犊牛腹泻甚至死亡的细菌，具有较高的发病率和死亡率，一直以来都是养牛业的一个巨大威胁。对于它的致病以及耐药机理的研究工作一直在持续的进行着。本试验先应用多重PCR技术对本实验室近两年来临床分离的53株牛源产肠毒素大肠杆菌进行耐药基因的检测，了解磺胺类、氯霉素类以及氨基糖苷类等各种耐药基因在这些菌株中的分布情况并进行分析。结果表明：耐药基因检出率分别为磺胺类耐药基因Sul1/Sul2（37.7%）、Sul3（9.4%），氯霉素类耐药基因Cat1（15.1%）、CmlA（13.2%）、Flor（15.1%），氨基糖苷类耐药基因aphA3（1.9%）、aadA（22.6%）、aacC2（22.6%）、aacC4（20.8%）。而后，应用对应的各类抗生素对其进行耐药基因与表型符合率的检测，结果发现：53株大肠杆菌中，对磺胺类、氨基糖苷类、氯霉素类抗生素耐药的菌株分别有29、28、17株，比例分别为54.7%、52.8%、32.1%，与耐药基因结果检测相符，说明这些耐药基因与耐药表型的符合率较高。然后通过致病性试验和毒力基因检测试验，选取毒力最强且具有毒力基因F41的Q919菌株做为Tester组，无毒力且无毒力基因的L001菌株做为Driver组；构建牛源产肠毒素大肠杆菌强毒株抑制消减基因组DNA文库。结果成功构建了182个清晰饱满的消减文库克隆，经PCR验证，阳性克隆为134个，阳性克隆比例为73.6%。经DNA测序，并运用DNAMAN软件分析和southern实验验证，最终确定有23条差异基因序列；通过BLASTN同源检索发现，这些序列在基因库中都存在同源性核酸序列，其中四条序列与大肠杆菌毒力岛基因和stx毒素基因同源性极高或为其全基因的一部分，疑为毒力基因片段；通过BLASTX同源检索发现，这些序列对应20个功能不同的蛋白质和3个未知功能的假定蛋白；它们有的与细菌能量代谢有关、有的与细菌蛋白合成与分泌有关、有的与细菌结构有关、有的与细菌毒力有关、有的与质粒调动有关。最后，通过测序所获得的基因组序列设计引物用于检验这些基因片段在其他临床牛源产肠毒素大肠杆菌中的分布。其中2、3、9、10、18、23、24、28、39等9条序列成功设计出检验引物，通过PCR技术对这些序列在53株牛源产肠毒素大肠杆菌中的分布进行调查分析，结果表明：10号序列在53株大肠杆菌中分布最为广泛，有48株大肠杆菌具有，覆盖率为90.6%；39号序列分布最少，仅有4株大肠杆菌具有，覆盖率为7.5%。本研究调查分析了53株牛大肠杆菌耐药基因分布情况，这将对牛源产肠毒素大肠杆菌病的临床用药具有指导作用。构建牛源产肠毒素大肠杆菌强毒株的抑制消减基因组DNA文库,并对差异基因进行了分析及分布研究，有利于找出毒力相关基因，为后续实验提供材料；了解其分布有利于我对具有抗原性的差异基因蛋白进行筛选，制造出对致病性大肠杆菌普遍有效的疫苗等。总之，本研究对ETEC的防治和致病机理等研究能够起到积极的作用。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-13
第一章文章综述  13-27
  1.1 前言  13
  1.2 牛大肠杆菌致病性  13-18
    1.2.1 黏附素  14-17
    1.2.2 肠毒素  17-18
  1.3 大肠杆菌对各种抗生素耐药性的研究进展  18-23
    1.3.1 磺胺类  19-20
    1.3.2 氨基糖苷类  20-21
    1.3.3 氯霉素类  21-23
  1.4 抑制性消减杂交（SUPPRESSION SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION，SSH）  23-25
    1.4.1 SSH 技术形成的历史背景  23
    1.4.2 SSH 的技术原理  23-24
    1.4.3 SSH 的优缺点  24
    1.4.4 SSH 的应用  24-25
  1.5 本实验的目的、意义  25-27
第二章牛源大肠杆菌耐药基因的检测  27-39
  2.1 材料  27-28
    2.1.1 菌株  27
    2.1.2 酶和试剂  27
    2.1.3 仪器设备  27-28
  2.2 大肠杆菌的分离与鉴定  28-29
    2.2.1 病料的采集  28
    2.2.2 细菌分离培养  28
    2.2.3 大肠杆菌的提纯及纯培养  28
    2.2.4 革兰氏染色镜检  28-29
  2.3 大肠杆菌耐药基因的检测  29-32
    2.3.1 磺胺类耐药基因的检测  29-30
    2.3.2 氨基糖苷类耐药基因的检测  30-31
    2.3.3 氯霉素类耐药基因的检测  31-32
  2.4 结果  32-36
    2.4.1 大肠杆菌的分离及鉴定结果  32-33
    2.4.2 大肠杆菌磺胺类耐药情况检测结果  33-34
    2.4.3 大肠杆菌氨基糖苷类耐药情况检测结果  34-35
    2.4.4 大肠杆菌氯霉素类耐药情况的检测结果  35-36
  2.5 讨论  36-39
第三章牛源 ETEC 强毒株基因组差异基因文库的构建  39-55
  3.1 材料  39-41
    3.1.1 实验菌株  39
    3.1.2 实验动物  39
    3.1.3 实验试剂  39
    3.1.4 主要仪器设备  39-40
    3.1.5 引物  40-41
  3.2 方法  41-48
    3.2.1 SSH 实验菌株的选取  41
    3.2.2 实验菌株基因组的提取  41-42
    3.2.3 基因组的酶切  42-43
    3.2.4 Adapter 连接  43
    3.2.5 连接效率检测  43-44
    3.2.6 第一次杂交  44-45
    3.2.7 第二次杂交  45-46
    3.2.8 PCR 扩增  46-47
    3.2.9 消减效率的 PCR 分析  47
    3.2.10 连接载体  47-48
    3.2.11 转化  48
  3.3 结果  48-52
    3.3.1 致病力实验结果  48-49
    3.3.2 Tester 和 Driver 组大肠杆菌毒力基因检测结果  49
    3.3.3 基因组 DNA 提取和酶切结果  49-50
    3.3.4 接头连接结果  50
    3.3.5 第二次 PCR 结果  50-51
    3.3.6 消减效率 PCR 分析结果  51
    3.3.7 消减基因文库的构建与克隆鉴定结果  51-52
  3.4 讨论  52-55
第四章牛源 ETEC 基因组差异基因分析  55-67
  4.1 材料  55-56
    4.1.1 菌株  55
    4.1.2 主要试剂  55
    4.1.3 主要仪器  55
    4.1.4 差异基因引物  55-56
  4.2 方法  56-59
    4.2.1 差异基因的测序  56
    4.2.2 Southern 杂交  56-58
    4.2.3 差异基因的分析  58
    4.2.4 差异基因的分布  58-59
  4.3 结果  59-64
    4.3.1 测序结果  59
    4.3.2 Southern 杂交结果  59-60
    4.3.3 差异基因同源序列检索结果  60-63
    4.3.4 差异基因分布检测结果  63-64
  4.4 讨论  64-67
    4.4.1 关于测序和 southern 实验  64-65
    4.4.2 关于序列同源性检索  65
    4.4.3 关于差异序列分布研究  65-67
第五章结论  67-68
参考文献  68-73
致谢  73-74
附录  74-81
个人简历  81

牛源ETEC基因组差异基因的筛选与分析

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