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大肠杆菌O157:H7活的非可培养态的检测

作　者: 罗中捷
导　师: 黄正
学　校: 华中科技大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生
关键词: 大肠杆菌O157:H7 VBNC ELISA IF
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC)中最重要的一种血清型,能产生志贺毒素、溶血素和黏附素导致出血性肠炎,肾溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜。80年代以来,全世界出现过多次大规模的暴发和流行。因此,快速准确的检测方法对预防和控制大肠杆菌O157:H7的感染十分重要。传统环境微生物的研究主要是依赖于平板培养,不仅耗时费力,而且不能精确地反映环境菌群的存活情况。1982年徐怀恕首次提出了细菌在外界环境中存在活的非可培养状态(viable but nonculturable,VBNC),微生物在环境胁迫因子的刺激下,通过一系列类似分化的遗传程序而使自身处于一种抵抗压力的状态,处于VBNC状态下的细菌不能在普通平板培养基上生长和形成菌落,在适宜的环境下,可以复苏并恢复生长,并保持一定的致病力。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是目前微生物检测常用的一种方法,该方法灵敏度高、特异性强、操作简便,甚至可以肉眼直接观察显色,在大量筛选和现场检测中有独特的优势,现已广泛应用于环境监测等领域。间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence,IF)也是基于抗原抗体结合的方法,其具有直观、特异性强等优点,不仅可以鉴定细菌的种类,还可以在荧光显微镜下观察细菌的形态变化。目前,这两种方法在检测VBNC状态大肠杆菌的方面的研究还不够完善,也缺乏同步对比分析。本文同时采用ELISA和IF检测VBNC状态的大肠杆菌O157:H7并比较各自的特点。目的监测大肠杆菌O157:H7在环境微生态汉江水与自来水中的存活情况;考察ELISA和IF检测VBNC大肠杆菌O157:H7的可行性。方法本实验将大肠杆菌O157:H7投加到模拟环境微生态的水体与自来水中,通过改变温度和营养条件,采用吖啶橙染色(acridine orange direct count,AODC)、5-氰基-2,3-二-(P-苄基-四唑氯化物)(CTC)染色(direct viable count-nucleic acid,DVC-CTC)、萘啶酮酸染色(direct viable count-nucleic acid,DVC-NA)和异养平板计数法(heterotrophic plate count,HPC)实时监测大肠杆菌O157:H7的存活情况。并同时采用ELISA和IF对处于转变各个时期的大肠杆菌O157:H7进行检测,对比分析两种方法的特点。结果1.在4℃、寡营养条件下,3.6×10~6CFU/mL大肠杆菌O157:H7在自来水中存活10d后进入VBNC状态,浓度为7.2×10~4CFU/mL;3.1×10~6CFU/mL大肠杆菌O157:H7在汉江水中存活58d后进入了VBNC状态,浓度为1.2×10~5CFU/mL。2.荧光染色显示CTC染色法检测活菌的能力要优于萘啶酮酸法。3.已建立的ELISA最佳工作参数为:鼠单抗浓度10μg/mL,3%BSA(10%小牛血清稀释液)封闭,鼠抗-HRP的稀释度1:1000,ELISA对大肠杆菌O157:H7的检测限为104CFU/mL。已建立的IF最佳工作参数为:鼠单抗浓度(效价) 1:100,羊抗鼠-FITC的浓度(稀释倍数) 1:60,反应时间为30min,IF对大肠杆菌O157:H7的检测限为103CFU/mL。ELISA、IF检测的是大肠杆菌O157:H7总菌数,与HPC、活菌染色分析结合可检测VBNC大肠杆菌O157:H7。结论汉江水中可培养的大肠杆菌O157:H7存活时间比自来水中长,更晚进入VBNC状态;DVC-CTC染色法更适于活菌检测;结合HPC、荧光染色分析,ELISA和IF均能检测出VBNC状态的大肠杆菌O157:H7。

大肠杆菌O157:H7活的非可培养态的检测

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