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微生物转化合成2’-脱氧腺苷

作　者: 王建琨
导　师: 刘国生；王振宇
学　校: 河南师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 2′-脱氧腺苷生物转化核苷磷酸化酶大肠杆菌纸层析-分光光度法
分类号: TQ464.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

2′-脱氧腺苷(dAR)是天然的脱氧核苷,天然的核苷类物质与生物生命活动密不可分,并且其有一定药用价值,可抑制胰岛素分泌。近年来dAR作为一种合成抗肿瘤、抗病毒核苷类化合物的中间体受到越来越高的关注。传统的生产脱氧核苷类物质的方法(核酸酶水解法)局限于有限的天然资源(主要从大马哈鱼卵中分离),并且分离提取纯品困难,化学合成法合成2′-脱氧腺苷又存在步骤复杂、异构体不好分离、转化率低、原料成本高、污染环境等问题,而利用微生物核苷磷酸化酶的高选择性生物转化合成2′-脱氧腺苷是一种理想的方法,目前已成为核苷类药物合成研究的研究热点。论文对2′-脱氧腺苷快速定性定量的测定和分离做了系统研究。建立了纸层析-分光光度法用于测定生物转化液中脱氧腺苷含量。用不同极性的展开剂进行纸层析分离转化体系中脱氧腺苷产物,分光光度法测定分离的脱氧腺苷浓度。测试了4种展开剂对脱氧腺苷的分离效果,发现用展开剂I(正丁醇:冰乙酸:水=6:1:3)和II(异丙醇:氨水:水=7:2:1)进行双向纸层析可将脱氧腺苷与其它成分分离,用展开剂IV(正丁醇:异丙醇:氨水:水=3:3:2:2)一次层析可将脱氧腺苷产物与其它成分分离。将分离的脱氧腺苷层析样点剪下并重新溶解后在258 nm处测定其吸光值,根据标准曲线即可计算出转化反应液中的产物浓度。用展开剂IV进行纸层析可将脱氧腺苷分离,进一步用分光光度计可测定其含量,该法与HPLC法一致,符合率达99.4 %以上,是一种简易有效的测定生物转化体系中脱氧腺苷含量的快速方法。论文进一步研究了利用大肠杆菌菌株的游离细胞进行生物转化合成脱氧腺苷试验,用纸层析法证明转化合成是成功的,有产物脱氧腺苷的合成反应发生。在此基础上对转化反应条件进行分析,建立了胸苷与腺嘌呤为底物的生物酶促转化合成2′-脱氧腺苷的反应体系,结果显示,最适转化反应温度为57℃,最适反应时间为4 h,磷酸钾缓冲液最适pH值为7.5、浓度为150 mmol/L,反应底物胸苷和腺嘌呤最适浓度分别为54 mmol/L、65 mmol/L,胸苷转化率为56.2 %。2′-脱氧腺苷的分离则采用离子交换柱与纸层析相接合的方法,解决了产物与底物间结构相似,不易分离的缺点。并通过多种鉴定方法(显色法、高效液相色谱法、液质联用、红外光谱法、核磁共振法)对所分离的合成产物进行鉴定,结果显示合成产物为2′-脱氧腺苷。

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摘要 4-6ABSTRACT 6-11第一章前言 11-23 1.1 核苷类药物的简介 11-16 1.1.1 抗病毒核苷类药物 12-13 1.1.2 抗肿瘤核苷类药物 13-14 1.1.3 核苷类与基因疗法 14-15 1.1.4 其他方面 15-16 1.2 核苷类药物及其中间体的合成现状 16-19 1.2.1 核酸酶水解法 16 1.2.2 化学合成法 16-17 1.2.3 微生物发酵法 17-18 1.2.4 生物酶法合成法 18-19 1.3 酶法合成核苷类药物在工业化应用中存在的问题 19-20 1.4 选题依据与意义 20-23第二章材料与方法 23-29 2.1 材料 23-24 2.1.1 菌种 23 2.1.2 培养基 23 2.1.3 仪器 23-24 2.1.4 试剂 24 2.2 方法 24-29 2.2.1 菌体制备 24-25 2.2.2 酶促转化 25 2.2.3 脱氧腺苷的简易定性定量测定 25-26 2.2.4 转化率测定 26 2.2.5 转化产物的分离提取 26-27 2.2.6 分析与鉴定 27-29第三章结果与分析 29-49 3.1 纸层析-分光光度法定性定量测定脱氧腺苷方法建立 29-33 3.1.1 纸层析展开剂的选择 29-32 3.1.2 纸层析-分光光度法测定脱氧腺苷的回收率 32-33 3.2 微生物转化合成脱氧腺苷条件优化 33-41 3.2.1 微生物转化体系与条件建立 33-34 3.2.2 pH 对酶促反应的影响 34-35 3.2.3 酶促反应的最适温度 35-36 3.2.4 最适温度和pH 条件下的转化过程分析 36-37 3.2.5 两种转化底物摩尔浓度配比与转化率的关系 37-38 3.2.6 磷酸钾缓冲液浓度对转化率的影响 38-39 3.2.7 最适底物浓度的确定 39-40 3.2.8 最适酶量的确定 40-41 3.3 产物的分离 41-44 3.3.1 游离菌体细胞与反应产物分离 41 3.3.2 离子交换提取反应产物 41-44 3.3.3 纸层析法制备小量产物样品 44 3.4 产物的鉴定 44-49 3.4.1 脱氧核糖基团的鉴定 44-45 3.4.2 高效液相色谱测定产物纯度 45-46 3.4.3 液质联用分析图 46-47 3.4.4 红外光谱法与核磁共振谱推定基团 47-49第四章结论 49-51 4.1 纸层析-分光光度法快速测定dAR 方法建立 49 4.2 酶反应条件的优化 49-50 4.3 2′-脱氧腺苷的分离与鉴定 50-51参考文献 51-59致谢 59-61攻读学位期间发表的学术论文 61-62

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