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FNR转录因子定向进化提高大肠杆菌对乙醇和丁醇的耐受性

作 者: 朱森康
导 师: 钟卫鸿
学 校: 浙江工业大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 大肠杆菌 转录因子 FNR 定向进化 乙醇耐受性 丁醇耐受性
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 67次
引 用: 1次
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内容摘要


大肠杆菌是目前基因工程的模式菌株和最为常用的外源蛋白原核表达系统。然而菌体常常需要在一些不利的环境中培养,各种代谢产物的积累会严重抑制重组菌的生长。对菌体进行有效改造,提高大肠杆菌对不利环境条件的忍耐性和适应性已成为微生物技术应用所需解决的一个重要问题。微生物性状的改变是体内多基因转录水平变化所导致的宏观反映,全局转录因子FNR直接或间接的调控着大肠杆菌细胞内大多数基因的表达。本研究以提高大肠杆菌对乙醇和丁醇的耐受性为目标,通过定向进化大肠杆菌全局转录因子FNR,从而直接或间接的调控菌体在全基因组规模上的转录水平,并采用有效的高通量筛选策略,得到性状改良的菌株。首先从大肠杆菌基因组中克隆FNR的编码基因,以pUC18质粒为载体,构建pUC18-fnr operon质粒。另外为模拟原始菌株中转录因子在基因组上转录表达的情况,以低拷贝数pSK质粒为载体,构建含fnr操纵子的pSK-fnr operon质粒。为提高低拷贝数pSK-fnr operon质粒转化大肠杆菌的转化效率,对高效大肠杆菌感受态细胞制备和电转化条件进行了优化,条件包括摇瓶装液量,菌体生长时期,转化电场强度以及转化后复苏时间,最终质粒转化效率达到1010 cfu/μg DNA,连接产物电转化达到105以上个转化子的转化效率,满足了下一步实验的要求。以构建好的pUC18-fnr operon质粒为模板,摸索易错PCR反应条件,确定突变率后通过易错PCR方法对fnr基因进行突变。突变基因替换低拷贝数pSK-fnr operon质粒中未突变基因,通过电转化方法导入E. coli DH5α,并分别在一定浓度乙醇或丁醇条件下进行筛选,获得乙醇或丁醇耐受性分别有一定程度提高的突变菌株。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章 文献综述  13-33
  1.1 引言  13-14
  1.2 转录因子  14-21
    1.2.1 转录因子结构特点  15-16
    1.2.2 全局转录因子FNR  16-19
    1.2.3 其它全局转录因子  19-20
    1.2.4 全局转录机制工程  20-21
  1.3 定向进化策略  21-25
    1.3.1 构建基因突变库方法  22-24
    1.3.2 突变文库筛选方法  24-25
  1.4 蛋白定向进化应用  25-26
  1.5 本研究的基本思路及拟研究内容  26-27
  1.6 参考文献  27-33
第二章 材料与方法  33-39
  2.1 实验材料  33-35
    2.1.1 质粒和菌株  33
    2.1.2 工具酶和主要试剂  33-34
    2.1.3 主要仪器  34-35
    2.1.4 培养基及缓冲液  35
  2.2 实验方法  35-38
    2.2.1 大肠杆菌基因组的提取  35
    2.2.2 琼脂糖凝胶核酸电泳和切胶回收DNA  35-36
    2.2.3 质粒的提取  36-37
    2.2.4 化学转化感受态细胞的制备及转化  37
    2.2.5 电转化感受态细胞的制备及电转化  37
    2.2.6 细菌细胞密度的测定  37-38
  2.3 参考文献  38-39
第三章 重组质粒pUC18-fnr operon和pSK-fnr operon的构建  39-51
  3.1 引言  39-40
  3.2 材料与方法  40-43
    3.2.1 菌株与质粒  40
    3.2.2 工具酶和主要试剂  40
    3.2.3 培养基和培养条件  40
    3.2.4 大肠杆菌基因组的提取  40
    3.2.5 PCR产物的纯化回收  40
    3.2.6 连接反应液的浓缩回收  40-41
    3.2.7 目的基因PCR扩增及双酶切反应  41
    3.2.8 重组质粒pUC18-fnr operon的构建  41-42
    3.2.9 重组质粒pSK-fnr operon的构建  42-43
  3.3 结果与分析  43-50
    3.3.1 大肠杆菌基因组的提取  43
    3.3.2 基因fnrTF和强终止子rrnB的扩增  43-44
    3.3.3 基因fnr的扩增  44-45
    3.3.4 重组质粒pUC18-fnr operon的构建  45-47
    3.3.5 重组质粒pSK-fnr operon的构建  47-50
  3.4 本章小结  50
  3.5 参考文献  50-51
第四章 高效大肠杆菌电转化感受态细胞制备和电转化条件的研究  51-59
  4.1 引言  51
  4.2 材料与方法  51-54
    4.2.1 菌种和质粒  51
    4.2.2 培养基和培养条件  51
    4.2.3 电转化感受态细胞的制备  51-52
    4.2.4 感受态细胞的电转化  52-53
    4.2.5 E. coli DH5α菌株的生长曲线  53
    4.2.6 不同生长时期制备的感受态细胞对电转化效率的影响  53
    4.2.7 装液量对感受态细胞电转化效率的影响  53
    4.2.8 电场强度和脉冲时间对电转化效率的影响  53
    4.2.9 转化后复苏时间对电转化效率的影响  53-54
  4.3 结果与分析  54-57
    4.3.1 E. coli DH5α的生长曲线  54
    4.3.2 不同生长时期制备的感受态细胞对电转化效率的影响  54-55
    4.3.3 装液量对感受态细胞电转化效率的影响  55
    4.3.4 电场强度和脉冲时间对电转化效率的影响  55-56
    4.3.5 转化后复苏时间对电转化效率的影响  56-57
    4.3.6 其它影响电转化效率的因素  57
  4.4 本章小结  57-58
  4.5 参考文献  58-59
第五章 定向进化FNR提高菌体的乙醇耐受性  59-73
  5.1 引言  59
  5.2 材料与方法  59-63
    5.2.1 菌株和质粒  59-60
    5.2.2 工具酶和主要试剂  60
    5.2.3 分子生物学基本操作  60
    5.2.4 培养基和培养条件  60
    5.2.5 易错PCR反应体系的摸索  60
    5.2.6 易错PCR扩增目的基因fnr  60-61
    5.2.7 突变基因mfnr连接质粒载体片段  61
    5.2.8 电转化及筛选培养  61-62
    5.2.9 乙醇耐受性的验证  62-63
  5.3 结果与分析  63-71
    5.3.1 易错PCR反应体系的摸索  63-64
    5.3.2 易错PCR产物mfnr的扩增  64
    5.3.3 突变基因mfnr连接质粒载体片段  64-67
    5.3.4 感受态细胞的电转化及筛选  67-68
    5.3.5 琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定  68
    5.3.6 乙醇耐受性的验证  68-71
  5.4 本章小结  71-72
  5.5 参考文献  72-73
第六章 定向进化FNR提高菌体的丁醇耐受性  73-84
  6.1 引言  73-74
  6.2 材料与方法  74-76
    6.2.1 菌株和质粒  74
    6.2.2 工具酶和主要试剂  74
    6.2.3 分子生物学基本操作  74
    6.2.4 培养基和培养条件  74
    6.2.5 易错PCR反应体系的摸索  74-75
    6.2.6 易错PCR扩增目的基因  75
    6.2.7 突变基因mfnr连接质粒载体片段  75
    6.2.8 电转化及筛选培养  75
    6.2.9 丁醇耐受性的验证  75-76
  6.3 结果与分析  76-82
    6.3.1 易错PCR反应体系的摸索  76-77
    6.3.2 易错PCR产物mfnr的扩增  77
    6.3.3 突变基因mfnr连接质粒载体片段  77
    6.3.4 感受态细胞的电转化及筛选  77-78
    6.3.5 琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定  78-79
    6.3.6 丁醇耐受性的验证  79-82
  6.4 本章小结  82
  6.5 参考文献  82-84
第七章 定向进化FNR提高菌体的厌氧耐受性初探  84-89
  7.1 引言  84
  7.2 材料与方法  84-85
    7.2.1 菌株  84-85
    7.2.2 主要试剂  85
    7.2.3 培养基和培养条件  85
    7.2.4 生长曲线测定  85
  7.3 结果与分析  85-87
    7.3.1 大肠杆菌生长曲线测定  85-87
  7.4 本章小结  87
  7.5 参考文献  87-89
第八章 结论与展望  89-91
  8.1 结论  89-90
  8.2 课题展望  90-91
致谢  91-92
攻读硕士学位论文期间主要科研成果  92

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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