学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用研究

作　者: 高继明
导　师: 周恩民
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体非肌肉肌球蛋白ⅡA RNA干扰免疫共沉淀 pull down 病毒阻断
分类号: S852.651
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 1次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）又名“蓝耳病”。是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一种接触性传染病。该病以繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。其病原具有典型的嗜单核细胞/巨噬细胞特性，在体内，PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolar macrophages, PAM），在体外，主要的易感细胞是非洲绿猴肾细胞MA-104及其衍生细胞Marc-145。PRRSV感染宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异受体结合，利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。至今，已经报道的与病毒感染相关的细胞蛋白由5个，分别为：唾液酸粘附素（Sialoadhesin, Sn）、似肝磷脂蛋白（Heparan sulphate， HS）、波形蛋白（Vimentin）、清道夫受体（CD163）和CD151蛋白。研究显示HS主要跟PRRSV与细胞的吸附相关，Sn则主要介导病毒的内吞，CD163则发挥协助Sn内吞，病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中的作用，CD151能够与PRRSV RNA3’UTR相互作用，转染CD151表达载体至PRRSV非易感细胞能使非易感细胞感染PRRSV，而且抗CD151蛋白的血清能够完全阻断病毒感染。细胞蛋白NMHC-ⅡA与PRRSV之间的关系是基于本实验室用模拟PRRSV GP5抗原表位的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)，通过免疫共沉淀从PAM和Marc-145中获得的一个分子量约为230kD的蛋白质，后经质谱分析和测序确定为非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（Non-myscle myosin heavy chain ⅡA，NMHC-ⅡA）。在动物体内，非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NMⅡ）重链有三种亚型，分别为：NMHC-ⅡA、NMHC-ⅡB、NMHC-ⅡC。此蛋白广泛分布在整个生物体内，主要与细胞的吸附，迁移和胞质分裂相关。目前关于NMHC-ⅡA功能的研究主要集中于针对其对细胞的生理功能研究，而与病毒感染之间研究鲜有可见，作为病毒受体已经有报道称NMHC-ⅡA是HSV-1的一个功能性受体，另外PRRSV的重要受体蛋白CD163已经被证明在淋巴细胞中可溶性的CD163可以与NMHC-ⅡA结合，但关于CD163在Marc-145细胞中是否与NMHC-ⅡA有相互关系，是NMHC-ⅡA和CD163共同在病毒感染过程中发挥作用还是NMHC-ⅡA能够另外独立发挥作用目前还没有报道证实。本研究针对NMHC-ⅡA与PRRSV之间的相互关系进行了以下几方面的分析：1、NMHC-ⅡA蛋白与PRRSV病毒粒子体外相互作用分析为了更加明确的分析NMHC-ⅡA与病毒的相互作用关系，我们通过免疫共沉淀方法提纯Marc-145细胞内的NMHC-ⅡA蛋白和通过原核表达纯化NMHC-ⅡA截短蛋白PRA蛋白，将蛋白标记到Dynabeads (免疫磁珠)上利用蛋白-病毒pull down技术对NMHC-ⅡA蛋白病毒之间的关系进行分析。检测结果显示，NMHC-ⅡA与PRA蛋白均能捕获病毒粒子，而对照组没有出现病毒粒子检测条带。2、抗NMHC-ⅡA蛋白血清对病毒的阻断作用分析作为PRRSV的细胞受体CD163、Vimentin、Sn、CD151等蛋白的抗血清均能够有效阻断病毒感染，为了判断NMHC-ⅡA作为一个潜在受体其血清是否也能够阻断病毒感染，我们利用通过免疫共沉淀提纯的NMHC-ⅡA蛋白免疫小鼠，分离血清进行PRRSV感染阻断实验。实验结果显示血清在1:5稀释时能够有效阻断病毒感染细胞，阻断效率达到80%，随着稀释度的增加阻断效率逐渐降低，稀释度达到1:20时对病毒的阻断作用几乎消失。3、NMHC-ⅡA蛋白低表达细胞系的建立与病毒感染分析为了分析病毒感染过程中NMHC-ⅡA与PRRSV的相互关系，我们利用RNA干扰技术，设计合成4条（miRNA-1、miRNA-2、miRNA-3、miRNA-4,）针对NMHC-ⅡA基因的miRNA对NMHC-ⅡA基因表达进行沉默，分析NMHC-ⅡA表达量降低对PRRSV感染Marc-145的影响，同时设计无关的miRNA序列作为对照。通过荧光定量测定分析发现miRNA-4序列能够有效降低NMHC-ⅡA在细胞内的表达；经过抗生素和单克隆筛选获得miRNA-4载体转染能够稳定传代的细胞株P-4，该细胞株的NMHC-ⅡA表达水平与对照细胞P-NC相比降低了47%。利用该细胞株进行PRRSV感染实验，结果显示4℃条件下病毒吸附细胞的量没有因为NMHC-ⅡA蛋白表达量的降低而产生显著改变。但病毒感染后的增殖，通过TCID50测定发现NMHC-ⅡA低表达细胞的病毒滴度显著下降，病毒在24、48、72、96h的滴度分别是对照细胞的57.9%、77.7%、86.8%和87.4%。结果证明NMHC-ⅡA表达量的降低能够影响病毒的增殖。但是对病毒增殖的影响程度呈逐渐减弱趋势。4、NMHC-ⅡA蛋白与PRRSV在Marc-145细胞上的共定位分析为了更直观的观察NMHC-ⅡA蛋白与PRRSV在病毒感染过程中的相互关系，我们在P-4、P-NC和Marc-145细胞上对病毒吸附和内化等不同时期进行固定，对NMHC-ⅡA蛋白和PRRSV进行了双荧光染色，利用共聚焦显微镜进行共定位分析，判断两者之间在量上的相互关系以及病毒感染与时间的关系。结果显示，病毒对三种细胞的吸附没有明显差异，但病毒吸附后内化的病毒量P-4细胞要明显低于对照细胞，该差异从内化15min后开始出现。关于病毒在不同细胞上的内化与时间的关系，通过观察发现，P-4细胞与对照细胞相比较病毒内化的时间明显推迟，P-4细胞开始出现内化的时间要比对照细胞晚15min左右。从P-4、P-NC和Marc-145细胞上都可以看到PRRSV的内化过程是伴随着NMHC-ⅡA蛋白的收缩而发生的，PRRSV从膜进入细胞质并向细胞核运动的时间相对较短，并且到达细胞核周围一定距离后在一定时间内位置相对不再变化。5、NMHC-ⅡA蛋白低表达细胞生长曲线，细胞周期测定和有丝分裂观察研究已经证明非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NM-Ⅱ）在细胞内的生物学功能主要与细胞的粘附，迁移和胞质分裂相关。为了分析我们筛选的NMHC-ⅡA低表达细胞系是否会因为NMHC-ⅡA降低47%的表达而显著影响细胞的正常生理功能从而对病毒的感染产生影响。我们对该细胞进行了生长曲线测定，细胞周期测定和细胞有丝分裂观察。结果显示降低47%NMHC-ⅡA表达的细胞与对照细胞相比生长曲线没有产生明显差异，细胞周期变化分布基本一致，细胞有丝分裂能够正常进行。

全文目录

中文摘要  11-14
Abstract  14-17
1 引言  17-40
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述  17-18
  1.2 PRRSV 生物学特性  18-24
    1.2.1 PRRSV 的分类地位  18
    1.2.2 PRRSV 的形态结构  18-19
    1.2.3 PRRSV 的基因组结构  19-24
  1.3 PRRSV 免疫学与致病机制的研究进展  24-27
    1.3.1 体液免疫反应  24-25
    1.3.2 细胞免疫反应  25-26
    1.3.3 PRRSV 的致病机制  26-27
  1.4 病毒的细胞受体  27-31
    1.4.1 病毒受体的概述  27-28
    1.4.2 病毒侵入宿主细胞的过程  28-29
    1.4.3 鉴定受体的方法  29-31
  1.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体的研究进展  31-40
2 材料与方法  40-69
  2.1 实验材料  40-42
    2.1.1 细胞、毒株与抗体  40
    2.1.2 实验动物  40
    2.1.3 主要试剂与药品  40
    2.1.4 载体与菌种  40-41
    2.1.5 试剂的配制  41-42
    2.1.6 仪器设备  42
  2.2 实验方法  42-69
    2.2.1 细胞的传代培养及 PRRSV 增殖  42-44
    2.2.2 间接免疫荧光检测  44
    2.2.3 目的蛋白的 SDA-PAGE 及 Western bolt 分析  44-47
    2.2.4 实时荧光定量检测  47-54
    2.2.5 PRRSV 受体蛋白 NMHC-ⅡA 与 PRRSV 的蛋白-病毒 pull down 分析  54-59
    2.2.6 PRRSV 受体蛋白 NMHC-ⅡA 抗血清对病毒的阻断分析  59-61
    2.2.7 PRRSV 受体蛋白 NMHC-ⅡA 低表达稳定细胞系的建立  61-65
    2.2.8 PRRSV 受体蛋白 NMHC-ⅡA 与病毒在 Marc-145 细胞上的共定位分析  65
    2.2.9 稳定敲低表达 NMHC-ⅡA 蛋白对 PRRSV 感染 Marc-145 细胞的影响  65-66
    2.2.10 NMHC-ⅡA 低表达对细胞生长的影响  66-67
    2.2.11 NMHC-ⅡA 低表达对细胞周期的影响  67-68
    2.2.12 NMHC-ⅡA 低表达对细胞有丝分裂的影响  68-69
3 结果与分析  69-92
  3.1 PRRSV 受体蛋白 NMHC-ⅡA 与 PRRSV 的 PULL DOWN 分析  69-72
    3.1.1 抗独特型抗体 5G2 及抗 PRRSV N 蛋白单克隆抗体 6D10 腹水制备与纯化.  69
    3.1.2 NMHC-ⅡA 截短蛋白 PRA 的表达与纯化  69-70
    3.1.3 抗独特型抗体 5G2 和 PRA 蛋白的免疫磁珠标记及蛋白-病毒 pull down 分析  70-72
  3.2 PRRSV 受体蛋白 NMHC-ⅡA 抗血清对病毒的阻断分析  72-74
    3.2.1 NMHC-ⅡA 蛋白的提取  72
    3.2.2 抗 NMHC-ⅡA 蛋白血清的采集与血清抗体效价测定  72-73
    3.2.3 血清阻断病毒的 FFN 检测  73-74
  3.3 PRRSV 受体蛋白 NMHC-ⅡA 稳定低表达细胞系的建立  74-80
    3.3.1 荧光定量引物扩增效率检测  74-76
    3.3.2 miRNA 表达载体敲低 NMHC-ⅡA 效率的测定  76-77
    3.3.3 稳定表达 miRNA 细胞系的筛选  77-79
    3.3.4 筛选细胞系的敲低效果测定  79-80
    3.3.5 筛选细胞系 CD163、vimentin 基因表达水平检测结果  80
  3.4 稳定低表达 NMHC-ⅡA 蛋白对 PRRSV 感染的影响  80-83
    3.4.1 稳定低表达 NMHC-ⅡA 细胞对 PRRSV 吸附的影响测定  80-82
    3.4.2 稳定敲低 NMHC-ⅡA 表达对 PRRSV 增殖的影响测定  82-83
  3.5 PRRSV 受体蛋白 NMHC-ⅡA 与病毒在 MARC-145 细胞上的共定位分析  83-85
  3.6 NMHC-ⅡA 低表达对细胞生长的影响  85-86
    3.6.1 标准曲线的构建  85
    3.6.2 生长曲线的测定  85-86
  3.7 NMHC-ⅡA 低表达对细胞周期的影响  86-90
    3.7.1 细胞生长的同步化  86-87
    3.7.2 不同生长时期细胞周期分布比例分析  87-90
  3.8 NMHC-ⅡA 低表达对细胞有丝分裂的影响  90-92
4 讨论  92-95
5 结论  95-96
参考文献  96-107
附录：常用溶液的配制  107-111
致谢  111-112
攻读学位期间发表论文情况  112

非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用研究

内容摘要

全文目录

相似论文