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一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析

作　者: 王卫青
导　师: 王心宇
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 菌核病 小繁缕 G蛋白偶联受体 农杆菌介导转化 油菜 烟草
分类号: S435.654
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


油菜(Brassica napus)是世界上主要的油料作物和重要的经济作物,在经济和农业生产中具有重要作用。核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病是油菜生产上的重要病害,但至今未发现免疫或者是高抗品种。小繁缕(Stellaria apetala Ucria)是一种常见的田间杂草,对核盘菌表现免疫性。研究核盘菌与小繁缕非寄主互作、与油菜寄主互作的分子机制,寻找抗病或者致病相关基因,对菌核病的防治有着重要的意义。Sspg1d是多聚半乳糖醛酸酶的一种,在核盘菌侵染寄主早期发挥作用的一个重要致病因子。本课题组将sspg1d作为诱饵,利用酵母双杂交方法筛选小繁缕cDNA文库,筛选到1个膜蛋白(命名为ppn20)。经实验证明,ppn20是一个G蛋白偶联受体,小繁缕在受到核盘菌诱导后表达量明显增加。本研究主要致力于研究ppn20的功能,利用农杆菌介导法对油菜与烟草进行转化,获得转基因植株,通过分子检测及表型分析推断ppn20基因的功能。我们将携带有ppn20基因的植物表达载体ppn20-pBinplus转化农杆菌后用农杆菌介导法对甘蓝型油菜进行遗传转化,经过kan+抗性筛选,成功获得10株阳性植株,其中7株成活；对阳性植株进行PCR和RT-PCR检测,发现目的基因成功导入油菜植株,大部分能顺利表达；对幼苗进行接种表型鉴定,结合分子鉴定结果,发现表达ppn20基因的植株均未能明显抵抗核盘菌的侵染或扩展,与非转基因的对照植株对核盘菌抵抗能力无明显差别。转基因烟草对核盘菌的抵抗能力与对照相似。将基因ppn20构建到植物表达载体PVX上,转化农杆菌后注射烟草,使基因ppn20在烟草中瞬时表达,然后对注射区域接种核盘菌,观察发现注射含ppn20基因农杆菌区域与注射含对照载体农杆菌区域抗病性无明显差别。利用基于泛素的酵母双杂交体系初步验证膜蛋白ppn20与G蛋白可能并不存在相互作用,这可能是造成ppn20基因的表达在油菜与烟草中不能正常表现对核盘菌抗性的原因。

全文目录


摘要  8-9ABSTRACT  9-11缩略词对照表  11-13第一部分 文献综述  13-37  引言  13-15  第一章 核盘菌以及植物抗病防卫机制的研究进展  15-25    1 核盘菌的特征与致病机理  15-19      1.1 核盘菌的分类与生物学特性  15      1.2 核盘菌的致病机理  15-17      1.3 核盘菌对寄主的侵染条件与侵染途径  17-18      1.4 核盘菌所致菌核病的症状及危害  18      1.5 油菜菌核病的防治意义  18-19    2 植物抗病防卫机制的研究进展  19-25      2.1 过敏性反应(hypersensitive reaction,HR)  20-21      2.2 系统获得性抗性(system acquired resistance SAR)  21-22      2.3 植物的非宿主抗性——宿主与病原物的互作机制  22-23      2.4 植物抗病反应的信号传导途径  23-25  第二章 植物离体组织培养与细胞再生的研究进展  25-29    1 植物组织培养的原理  25-26      1.1 植物细胞的全能性  25      1.2 细胞分化与形态建成  25      1.3 植株的再生  25-26    2 植株再生的途径  26      2.1 胚状体途径  26      2.2 器官发生途径  26        2.2.1 器官间接发生途径  26        2.2.2 器官直接发生途径  26    3 植物转基因的研究进展  26-29  第三章 G蛋白与G蛋白偶联受体(GPCRs)的研究进展  29-37    1 G蛋白的结构与功能  29-30      1.1 异源三聚体G蛋白的结构  29-30      1.2 异源三聚体G蛋白的功能研究  30    2 G蛋白偶联受体(GPCRs)的研究进展  30-33      2.1 GPCRs的结构与分类  31-32        2.1.1 GPCRs的结构  31        2.1.2 GPCRs的分类  31-32      2.2 GPCRs激活的分子机制  32-33      2.3 GPCRs二聚化的功能  33    3 基于分离泛素的杂交系统(split-ubiquitin system)  33-37第二部分 研究报告  37-71  第四章 G蛋白偶联受体功能的初步研究  37-63    1 材料与方法  38-50      1.1 植物品种  38      1.2 基因来源  38      1.3 菌株和质粒  38      1.4 实验仪器与试剂  38-39      1.5 培养基  39-41        1.5.1 细菌培养基  39        1.5.2 植物培养基  39-41      1.6 大肠杆菌质粒DNA提取(碱裂解法)参考《分子克隆实验指南》  41      1.7 质粒DNA的酶切与PCR验证  41-42      1.8 质粒DNA与连接产物的转化  42      1.9 植物表达载体的农杆菌转化  42-43      1.10 农杆菌质粒的提取  43-44      1.11 农杆菌介导的油菜遗传转化  44-45        1.11.1 无菌苗制备  44        1.11.2 农杆菌培养  44        1.11.3 农杆菌侵染和共培养  44        1.11.4 芽诱导与愈伤组织诱导  44-45        1.11.5 愈伤组织的分化和植株再生  45      1.12 农杆菌介导的烟草遗传转化  45-46        1.12.1 无菌外植体制备  45        1.12.3 农杆菌培养  45        1.12.4 农杆菌侵染和共培养  45        1.12.5 愈伤组织诱导  45-46        1.12.6 愈伤组织的分化和植株再生  46      1.13 再生植株的PCR检测  46-47        1.13.1 油菜、烟草基因组DNA的提取方法(CTAB法)  46-47        1.13.2 再生植株的PCR检测扩增  47      1.14 转基因植株RNA的提取以及RT-PCR检测  47-49        1.14.1 油菜、烟草总RNA的提取方法(Trizol法)  47-48        1.14.2 总RNA的DNA消化  48        1.14.3 mRNA反转录为cDNA  48        1.14.4 RT-PCR检测  48-49      1.15 转基因植株的抗性鉴定  49      1.16 小繁缕膜蛋ppn20与油菜G蛋白的互作  49-50        1.16.1 小量LiAc/PEG法制备酵母感受态细胞  49-50        1.16.2 质粒转化酵母感受态细胞  50    2 结果与分析  50-60      2.1 ppn20-pBplus载体PCR鉴定  50-51      2.2 植物表达载体的农杆菌转化  51      2.3 植株遗传转化转基因植株的获得  51-54        2.3.1 ppn20基因的油菜遗传转化及转基因植株的获得  51-53        2.3.2 ppn20基因的烟草遗传转化及转基因植株的获得  53-54      2.4 转基因植株的PCR检测  54-55        2.4.1 转基因油菜PCR检测  54-55        2.4.2 转基因烟草PCR检测  55      2.5 转基因植株核盘菌抗性鉴定  55-57        2.5.1 转基因油菜的离体叶片接种鉴定  55-56        2.5.2 转基因烟草的离体叶片接种鉴定  56-57      2.6 转基因植株的RT-PCR检测  57-58        2.6.1 转基因油菜的RT-PCR检测  58        2.6.2 转基因烟草的RT-PCR检测  58      2.7 ppn20与油菜G蛋白之间的相互作用  58-60    3 讨论  60-63  第五章 通过瞬时表达研究ppn20的功能  63-71    1 材料与方法  63-66      1.1 植物品种  63      1.2 菌株和质粒  63      1.3 培养基  63      1.4 农杆菌表达载体ppn20-PVX的构建  63-65        1.4.1 质粒DNA的酶切  64        1.4.2 目的片段的回收  64        1.4.3 连接反应  64        1.4.4 连接产物的转化  64-65        1.4.5 重组质粒的鉴定  65        1.4.6 表达载体的农杆菌转化  65        1.4.7 农杆菌质粒的提取  65        1.4.8 菌落的PCR检测  65      1.5 农杆菌介导的植物瞬时表达抗病性鉴定  65-66    2. 结果与分析  66-70      2.1 农杆菌表达载体的构建与鉴定  66-70        2.1.1 ppn20-PVX载体构建  66-67        2.1.2 ppn20-PVX载体PCR鉴定  67-68        2.1.3 植物表达载体的农杆菌转化  68-69        2.1.4 农杆菌介导ppn20基因在烟草中瞬时表达  69-70    3. 讨论  70-71全文结论  71-73参考文献  73-79附录  79-81致谢  81

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 油料作物病虫害 > 油菜子（芸苔）病虫害
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