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hELP3与hELP4、yELP4及CTK1间相互作用的研究

作　者: 张帅
导　师: 李芬
学　校: 河南师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Elongator复合物 ELP3 CTK1 酵母双杂交 AH109酵母菌株 GST pull-down
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


组蛋白甲基化、乙酰化等表观遗传修饰对基因表达有重要影响。已有的研究结果表明,酵母Elongator复合物作为一个具有组蛋白乙酰基转移酶活性的复合体,协助RNA聚合酶Ⅱ参与GAL1,SSA3等基因的转录延伸过程。人Elongator复合物已从HeLa细胞中被分离出来,并有研究表明它与酵母Elongator复合物的组成高度保守,功能极为相似。Elongator复合物中最引人瞩目的是它的ELP3亚基,它有组蛋白乙酰转移酶活性,从属于GNAT家族。缺失ELP3亚基可导致多种生长缺陷,其中有些与转录延伸缺陷相关。有报道称ELP3蛋白在神经生物学中也发挥着至关重要的作用。Elongator复合物可对组蛋白H3的第14位赖氨酸和组蛋白H4的第8位赖氨酸进行乙酰化修饰,且ELP3亚基C末端的保守的HAT活性中心为Elongator行使功能所必需。生物信息学分析研究表明,ELP3的N末端有一个类似于S-腺苷甲硫氨酸激酶的结构域,这个结构域包含Fe4S4簇,可结合S-腺苷甲硫氨酸。ELP4也是Elongator复合物的组成成分之一,Elongator复合物参与转录和RNA的修饰过程。Elongator复合物的消耗将导致与细胞能动性和细胞位移有关的基因的脑特异性下调表达。我们认为ELP4基因中非编码序列的突变将阻碍Elongator复合物介导的脑特异性的基因间的相互作用,从而影响脑部发育,导致癫痫发作和神经发育紊乱。基于以上研究成果,本论文构建了”诱饵”融合质粒pGBKT7-hELP3和“猎物”融合质粒pGADT7-Rect-yELP4,pGADT7-Rect-hELP4,pGADT7-Rect-CTK1,分三组共转化入AH109酵母菌菌株中,通过酵母双杂交实验初步检测ELP3与其他三种蛋白在生理状态下有无相互作用,并通过GST pull-down实验在体外对酵母双杂交实验获得的结果进一步验证。实验结果表明,hELP3亚基与hELP4之间存在相互作用,而hELP3亚基与yELP4和CTK1之间没有相互作用,酵母双杂交实验及pulldown验证实验也证实了以上结果。

全文目录


摘要  4-5ABSTRACT  5-7缩略语  7-11第一章 引言  11-27  1.1 Elongator 复合物及Elp3 的功能  11-16    1.1.1 Elongator 复合物  11-14    1.1.2 ELP3 的功能  14-16  1.2 CTK1 的功能研究  16-18  1.3 酵母双杂交系统  18-22    1.3.1 酵母双杂交系统的建立  18-19    1.3.2 酵母双杂交系统的原理及组成  19-20    1.3.3 酵母双杂交系统的应用  20-21    1.3.4 酵母双杂交系统特点  21-22    1.3.5 酵母双杂交系统的拓展  22  1.4 GST Pull-down 技术  22-23  1.5 其他研究蛋白质相互作用的方法  23-26    1.5.1 免疫共沉淀技术  23-24    1.5.2 串联亲和纯化技术  24-26  1.6 IPTG 诱导蛋白表达的原理  26-27第二章 材料与方法  27-50  2.1 试验材料  27  2.2 主要试剂及常用溶液配方  27-32  2.3 主要实验仪器  32-33  2.4 实验方法  33-50    2.4.1 基因的扩增  33    2.4.2 PCR 产物的检测  33-34    2.4.3 PCR 产物的纯化  34    2.4.4 真核穿梭载体的构建  34-39    2.4.5 原核表达载体的构建  39-43    2.4.6 “诱饵”和“猎物”融合质粒的自激活测定  43-44    2.4.7 诱饵蛋白有无渗漏的检测  44    2.4.8 诱饵蛋白在酵母中的毒性作用检测  44-45    2.4.9 酵母双杂交验证蛋白间的相互作用  45    2.4.10 原核表达载体转化入BL21（DE3）  45    2.4.11 蛋白的诱导表达  45-46    2.4.12 SDS-PAGE 分析表达产物  46    2.4.13 检测“诱饵”和“猎物”是否是可溶性蛋白  46    2.4.14 pull down 验证hELP3 与CTK1，hELP4，yELP4 的互作关系  46-48    2.4.15 SDS-PAGE 和western-blot 检测pull down 结果  48-50第三章 实验结果与分析  50-65  3.1 hELP3 与CTK1、yELP4、hELP4 相互作用的酵母双杂交分析  50-56    3.1.1 AD、BD 融合质粒的构建  50-53    3.1.2 BD 融合质粒有无渗漏表达的检测及 AD、BD 融合质粒的自激活检测  53-55    3.1.3 诱饵质粒的毒性作用检测  55    3.1.4 AD 融合蛋白与BD 融合蛋白间相互作用的双杂交检测  55-56  3.2 GST 融合的hELP3 与CTK1、hELP4、yELP4 相互作用的GST pull down 验证  56-65    3.2.1 原核表达载体的构建  56-58    3.2.2 诱饵和猎物蛋白的诱导与SDS-PAGE 检测  58-60    3.2.3 诱饵、猎物蛋白的可溶性检测  60-62    3.2.4 hElp3 与CTK1、hElp4、yElp4 间相互作用的pull down 验证  62-65第四章 讨论  65-71  4.1 实验技术的改进与实验条件的优化  65-68    4.1.1 酵母双杂交假阳性的控制  65-66    4.1.2 原核表达系统的选择  66    4.1.3 融合蛋白的诱导表达条件的优化  66-67    4.1.4 Pull down 验证蛋白互作与问题解决  67-68  4.2 对于本文所得结果的综合分析讨论  68-71结论  71-72参考文献  72-76致谢  76-77攻读学位期间发表的学术论文目录  77-78

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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