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TGEV S/M双基因减毒沙门氏菌核酸疫苗株初步构建研究

作　者: 刘佳文
导　师: 文心田
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 M基因 减毒沙门氏菌 DNA疫苗 口服免疫
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的猪的高度传染性肠道疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。S、M是TGEV两个重要的功能蛋白,本研究构建了携带TGEV的S、M基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗,并以小鼠为模型进行了前期初步免疫评价。1.S、M基因真核表达载体的构建参照GenBank中TGEV Purdue株的基因序列,设计一对特异性引物,采用RT-PCR扩增M基因(989bp),构建了其T载体克隆质粒pMD19T-M,将M基因插入pVAX载体构建了pVAX-M。将M基因亚克隆入双顺反子真核表达质粒pIRES,使M基因位于IRES序列下游的多克隆位点上,构建了中间表达质粒pIRES-M;用EcoR I和Not I对质粒pIRES-M进行双酶切,获得了1639bp的IRES-M片段,并将其插入pVAX-S(前期构建)中,使IRES-M片段位于S基因的下游,构建了双顺反子真核表达质粒pVAX-S-M,并经PCR和双酶切鉴定。将表达质粒pVAX-M、pVAX-S和pVAX-S-M pVAX空质粒转染HEK293细胞,并在转染后72h以RT-PCR检测转染结果。结果显示除对照组pVAX外,pVAX-M、pVAX-S和pVAX-S-M均检测到目的基因的转录。2.减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的S、M基因口服疫苗的构建及鉴定将真核质粒电转pVAX-M和pVAX-S-M pVAX入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建重组菌SL7207(pVAX-M)和SL7207(pVAX-S-M)。将这两种重组菌分别以5×108CFU、1×109CFU和2×109CFU的剂量口服灌胃小鼠,首免后2周加强免疫一次,并在首免后每隔一周每组随机扑杀3只小鼠,观察器官病变和菌落计数。首免后1-4w各组都可检测到细菌,5w时5×108CFU两个免疫组已无细菌检出,6w时所有重组菌组均无细菌生长,表明重组减毒沙门氏菌具有良好的安全性。3.减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的S、M基因口服疫苗的初步免疫评价将SL7207(pVAX-S)、SL7207(pVAX-M)、SL7207(pVAX-S-M)和SL7207(pVAX-S)+SL7207(pVAX-M)以1×109CFU的剂量口服免疫小鼠,共免疫三次,每次间隔两周,分别在免疫后的第2W、4W、6W、8w以间接ELISA检测血清IgG和肠道黏膜IgA抗体,以试剂盒检测血清Y-干扰素和IL-4水平。结果表明：在首免后第2w,可以检测到血清IgG抗体(P<0.05)和黏膜IgA抗体。第6w所有组均达到抗体最高峰,第8w两种抗体水平均开始下降。间接ELISA检测小鼠血清中的IL-4和IFN-y的含量,结果显示：①首免后第2w起,各重组菌组的IL-4含量明显升高,而两个对照组的含量始终维持在一个较低水平。同时SL7207(pVAX-S-M)双基因组的含量从第2w起到第8w都保持上升的趋势,在第8w最高可达99.308pg/mLo②首免后第2w起,各组的IFN-y含量都明显的升高,而两个对照组的含量始终维持在一个较低的水平。SL7207(pVAX-S)+SL7207(pVAX-M)单基因混合组的IFN-y含量在免疫6w前都略高于其它组,在第6w可高达729.622pg/mL。第8w,各组的IFN-y含量较6w都有下降,但SL7207(pVAX-S-M)双基因组下降幅度的较其它组小,IFN-y含量也较其它组略高,达到507.739pg/mL。结果表明重组菌口服免疫小鼠具有良好的免疫原性,可诱导免疫小鼠产生特异性的血清IgG以及肠道IgA抗体,同时能诱发明显的细胞免疫应答。

全文目录


英文縮略表  5-10
摘要  10-12
Abstract  12-15
第一章 文献综述  15-24
  前言  15
  1 TGEV的病原特征  15-20
    1.1 形态学特征  15-16
    1.2 病毒的抗原性  16
    1.3 病毒的理化特性  16-17
    1.4 TGE流行病学  17-18
    1.5 TGEV致病机制  18
    1.6 病原分子生物学  18-20
  2 以减毒沙门氏菌作为核酸疫苗活载体的研究  20-22
    2.1 减毒沙门氏菌入侵机体免疫系统的可能机制  20-21
    2.2 减毒沙门氏菌的作为DNA疫苗载体的优势与应用  21-22
  3. 内部核糖体进入位点(IRES)序列  22-23
  4 研究的目的和意义  23-24
第二章 试验部分  24-71
  1 材料与试剂仪器  24-26
    1.1 生物材料  24
    1.2 试剂  24-25
    1.3 试剂配制  25-26
    1.4 主要仪器设备  26
  2. 方法  26-45
    2.1 M基因重组质粒pVAX-M、pIRES-M、pVAX-S-M的构建  26-39
      2.1.1 引物设计  26-27
      2.1.2 TGEV M基因的获取  27-28
      2.1.3 M基因T-A克隆载体的构建与鉴定  28-30
      2.1.4 M基因克隆重组质粒的鉴定  30-32
      2.1.5 M基因真核表达质粒pVAX-M的构建  32-33
      2.1.6 S、M双基因真核表达质粒pVAX-S-M的构建  33-37
        2.1.6.1 技术路线图  33-34
        2.1.6.2 中间表达质粒pIRES-M的构建  34-35
        2.1.6.3 S、M双基因表达质粒pVAX-S-M的构建  35-37
      2.1.7 重组质粒pVAX-S、pVAX-M、pVAX-S-M的体外表达  37-39
    2.2 携带S、M双基因DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建与鉴定  39-43
      2.2.1 减毒沙门氏菌SL7207感受态细胞的制备  39-40
      2.2.2 重组质粒pVAX-S-M及pVAX-M的抽提  40
      2.2.3 减毒沙门氏菌SL7207的电转化  40-41
      2.2.4 重组减毒沙门氏菌的鉴定  41
      2.2.5 体外重组减毒沙门氏菌中质粒的稳定性  41
      2.2.6 小鼠体内感染重组减毒沙门氏菌后RT-PCR检测基因转录.  41-42
      2.2.7 重组减毒沙门氏菌对小鼠的安全性试验  42-43
    2.3 携带S、M双基因DNA疫苗减毒沙门氏菌的初步免疫评价  43-45
      2.3.1 试验小鼠分组、免疫及样品采集  43
      2.3.2 特异性TGEV血清IgG和肠道粘膜IgA抗体测定  43-44
      2.3.3 免疫小鼠白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的测定  44-45
  3. 结果与分析  45-66
    3.1 M基因重组质粒pVAX-M、pIRES-M、pVAX-S-M的鉴定  45-52
      3.1.1 M基因的RT-RCR结果  45
      3.1.2 M基因重组质粒pMD19T-M的鉴定  45-47
        3.1.2.1 菌落PCR及酶切鉴定  45-46
        3.1.2.2 M基因序列测定与分析结果  46-47
      3.1.3 M基因真核表达质粒pVAX-M的鉴定  47-49
      3.1.4 M基因中间表达质粒pIRES-M的鉴定  49-51
      3.1.5 S、M双基因真核表达质粒pVAX-S-M的鉴定  51-52
      3.1.6 重组质粒pVAX-M、pVAX-S-M、pVAX-S转染后的RT-PCR检测  52
    3.2 重组沙门氏菌菌株的鉴定  52-58
      3.2.1 转入减毒沙门氏菌SL7207的质粒pVAX-M、pVAX-S-M的鉴定  52-54
      3.2.2 重组减毒沙门氏菌的体外稳定性试验  54-55
      3.2.3 重组减毒沙门氏菌体内感染小鼠后RT-PCR检测基因的转录  55-56
      3.2.4 重组减毒沙门氏菌对小鼠的安全性试验  56-58
    3.3 携带S、M双基因DNA疫苗减毒沙门氏菌的初步免疫结果  58-66
      3.3.1 抗TGEV特异性血清IgG的检测  58-59
      3.3.2 抗TGEV特异性肠道IgA检测  59-61
      3.3.3 免疫小鼠白细胞介素4(IL-4)测定  61-63
      3.3.4 免疫小鼠干扰素γ(IFN-γ)测定  63-66
  4. 讨论  66-70
    4.1 引入IRES序列的双顺反子表达载体的构建  66
    4.2 重组质粒的体外表达  66-67
    4.3 选择减毒沙门氏菌SL7207作为疫苗载体的原因  67-68
    4.4 免疫小鼠后机体抗TGEV特异性IgA和IgG含量变化的探讨  68-69
    4.5 免疫小鼠后机体细胞因子IL-4和IFN-γ含量变化的探讨  69
    4.6 本试验需要完善的地方  69-70
  5. 结论  70-71
参考文献  71-76
致谢  76-77
附录  77-78

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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