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猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联RT-PCR诊断方法的建立及初步应用

作　者: 黄海龙
导　师: 胡桂学
学　校: 吉林农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒诊断二联RT-PCR 初步应用
分类号: S854.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

猪传染性胃肠炎（TGE）和猪流行性腹泻（PED）均是由冠状病毒引起的以仔猪呕吐、腹泻和脱水为特征的两种传染病。目前，TGE和PED的诊断方法主要有病毒中和试验、免疫荧光法、免疫电镜法、ELISA和RT-PCR法等。随着分子生物学技术的不断发展，ELISA和RT-PCR法以其敏感性高、特异性强越来越受到人们的重视。本研究所用TGEV和PEDV可在PK15细胞中大量增殖。在PK15细胞上分别培养TGEV和PEDV，待70％细胞出现CPE时收毒。应用Reed-Muench法测得TGEV和PEDV的TCID₅₀。结果为：TGEV的TCID₅₀为10^-4.8／0.1mL。查反对数得63095，即该TGEV液63095倍稀释液0.1 mL等于1个TCID₅₀。PEDV的TCID₅₀为10^-4.2／0.1mL。查反对数得15849，即该PEDV液15849倍稀释液0.1 mL等于1个TCID₅₀。又在Genbank中查出猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的基因组序列，结合两种病毒基因组结构特点，在对两种病毒基因序列进行同源性比较的基础上，选择二者的S蛋白基因为引物设计区。根据多重PCR引物设计原则，应用Primer5.0软件设计了TGEV和PEDV各两条引物。其中，TGEV的引物可扩增出426bp的特异片段，PEDV的引物可扩增出584bp的特异片段。经过引物浓度和MgCl₂浓度滴定、退火温度确定等PCR反应条件的优化，确定TGEV和PEDV单项RT-PCR体系的最佳条件分别为，引物浓度：TGEV 0.8-1.6μmol／L、PEDV 0.4μmol／L；MgCl₂浓度：TGEV为2mmol／L，PEDV为2mmol／L；退火温度：TGEV为54℃，PEDV为52℃-54℃。经敏感性试验确定，TGEV RT-PCR可检测0.63 TCID₅₀的模板，PEDV RT-PCR可检测1.6 TCID₅₀的模板。在此基础上，经PCR反应条件的优化，建立了TGEV和PEDV的二联RT-PCR，其最佳系统组成为，引物浓度：TGEV为0.6μmol／L，PEDV为0.4μmol／L；MgCl₂浓度为2mmol／L，dNTP浓度为100μmol／L。最佳循环条件为：94℃1min→56℃50s→72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。本试验建立的TGEV和PEDV的二联RT-PCR可在同一反应中，同时扩增出这两种病毒不同大小的两个特异性核苷酸片段，以建立的二联RT-PCR扩增其它对照病毒未见阳性反应。并确定该二联RT-PCR可检测TGEV6.3TCID₅₀的模板，PEDV15.8TCID₅₀的模板，比单项RT-PCR的敏感性分别下降了一个数量级。用建立的二联RT-PCR方法对50份临床采集病料进行检测，检出TGEV8份，PEDV3份。TGEV占被检病料的16％，PEDV占被检病料的6％。同时，所检病料中发现1份TGEV和PEDV混合感染，证实在临床病例中有TGEV和PEDV的混合感染存在。吉林农业大学硕士学位论文TGEV和PEDV二联RT一PCR方法的建立及初步应用初步应用证明，该二联RT一PCR具有良好的敏感性和特异性。本研究为这两种疾病的临床诊断提供进一步可借鉴的方法，具有着潜在的应用价值。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-19
  1 TGE诊断方法及分子生物学特性  9-13
  2 PED诊断方法及分子生物学特性  13-16
  3 PCR诊断技术的研究进展  16-19
研究内容  19-41
  1 材料  19-20
  2 方法  20-23
  3 结果  23-37
    3.1 病毒培养结果  23
    3.2 TGEV和PEDV TCID_(50)的测定结果  23-25
    3.3 TGEV和PEDV的S蛋白基因引物设计结果  25-26
    3.4 PCR扩增结果  26-27
    3.5 PCR条件优化结果  27-32
    3.6 多重RT-PCR建立及初步应用  32-37
  4 讨论  37-41
结论  41-42
参考文献  42-47
致谢  47

猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联RT-PCR诊断方法的建立及初步应用

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