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MCM2在小鼠子宫蜕膜化过程中作用的研究

作　者: 韩雪
导　师: 石放雄；王海滨
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 基质细胞增殖蜕膜化 MCM2
分类号: Q492
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

胚胎植入和子宫的蜕膜化反应是哺乳动物妊娠过程中的两个关键事件,很大程度上影响妊娠的成功率。胚胎植入是具有植入能力的囊胚与处于接受态的子宫之间进行复杂信息交流的过程,可分为定位、粘附和侵入三个阶段。胚胎粘附反应发生后,子宫的基质细胞经过大量的增殖、分化、多核化过程形成蜕膜化细胞,这一过程称为子宫的蜕膜化反应。蜕膜组织的重要作用之一是在胎盘形成前为胚胎发育提供营养和母胎间免疫保护,而蜕膜细胞的逐渐退化又为胎儿的生长提供了空间。子宫的蜕膜化异常会导致胎盘缺陷、宫内发育迟缓及早产等妊娠相关疾病,对妊娠结局有着重要的影响。子宫的蜕膜化过程主要涉及到基质细胞的增殖,因此基质细胞的增殖状态会直接影响子宫的蜕膜化反应。尽管先前的研究表明多种分子都参与子宫的蜕膜化进程,但是我们对于蜕膜化过程中细胞增殖、分化的调控机制仍然知之甚少。MCM2-7复合体在真核细胞DNA的复制启动过程中起着复制许可作用,确保每个细胞周期中DNA仅复制一次；而在DNA的复制延伸过程中起着解旋酶的作用,解开双链DNA。 MCM2作为该复合体的成员之一起着至关重要的作用。MCM2的表达与细胞增殖密切相关,在静止期细胞中含量很少,在增殖细胞中含量很多。而MCM2的缺失可以抑制细胞的增殖,破坏染色体的稳定性,引发DNA损伤,导致细胞凋亡。鉴于MCM2对细胞增殖所起的重要作用,在本研究中我们首次探讨了MCM2在小鼠子宫基质细胞蜕膜化过程中的作用机制。利用原位杂交等实验方法,我们发现Mcm2-7在小鼠的围植入期子宫中呈现动态的时空表达模式,随着子宫基质细胞的增殖其表达逐渐增强。为了研究MCM2在蜕膜化过程中的作用,我们利用小鼠基质细胞体外培养诱导蜕膜化模型,通过RNAi技术特异性沉默Mcm2基因。我们发现Mcm2的沉默会导致子宫基质细胞的增殖受到抑制,基质细胞蜕膜化反应出现异常。此外,我们的研究还发现Mcm2基因的沉默会引起细胞周期的紊乱,细胞周期调节因子CyclinD3和CDK4的表达下降,具有蜕膜促进作用的分子Wnt4的表达也下降,说明MCM2在子宫蜕膜化过程中具有调节细胞周期的作用。总之,本研究第一次证明了MCM2对子宫基质细胞增殖和蜕膜化的重要作用,为今后研究基质细胞蜕膜化过程中细胞增殖、分化的调节机制奠定了基础。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
縮略词（Abbreviation)  9-10
一、文献综述  10-24
  1. 胚胎植入过程及调控  10-13
    1.1 小鼠胚胎植入过程概述  10-11
    1.2 胚胎植入过程中雌孕激素调节模式  11-13
  2 植入后子宫蜕膜化  13-18
    2.1 子宫基质细胞蜕膜化  13
    2.2 蜕膜化过程中分子调节机制  13-16
    2.3 细胞周期调控因子在蜕膜化过程中发挥重要作用  16-18
  3 MCMS家族概述  18-24
    3.1 MCMs蛋白家族概述  18-20
    3.2 MCM2-7复合体在DNA复制过程中的作用  20-22
      3.2.1 MCM2-7复合体在DNA复制起始过程中的作用  21
      3.2.2 MCM2-7复合体在DNA复制解旋、延伸过程中的作用  21-22
      3.2.3 MCM2-7复合体在防止DNA复制损伤过程中的作用  22
    3.3 MCM2的作用和研究进展  22-24
      3.3.1 MCM2在DNA复制过程中的作用  22
      3.3.2 MCM2在癌症研究中的进展  22-24
二、研究内容  24-50
  1. 材料  24-25
    1.1 主要仪器  24
    1.2 实验动物  24-25
  2 方法  25-35
    2.1 子宫基质细胞体外培养  25
    2.2 总RNA的提取和QRT-PCR  25-27
      2.2.1 (Trizol试剂抽提法)  25-26
      2.2.2 RNA反转录  26
      2.2.3 Quantitative Real-time PCR反应体系  26-27
    2.3 Western Blotting  27-28
      2.3.1 蛋白提取  27-28
      2.3.2 蛋白的浓度测定  28
      2.3.3 试验步骤  28
    2.4 免疫荧光(Immunofluorescence)  28-29
    2.5 组织免疫化学  29-30
      2.5.1 取材及样品处理  29-30
      2.5.2 免疫组织化学步骤  30
    2.6 原位杂交  30-32
      2.6.1 组织材料的保存和切片  30-31
      2.6.2 放射性核酸探针的构建与标记  31
      2.6.3 杂交具体流程  31-32
    2.7 流式细胞术  32-33
    2.8 细胞增殖检测  33
    2.9 RNAi转染  33-34
    2.10 数据分析  34-35
  3 结果与分析  35-47
    3.1 Mcms在围植入期小鼠子宫中呈动态的时空表达模式  35-39
    3.2 Mcm2在体外培养基质细胞中的表达与细胞的增殖、分化密切相关  39-41
    3.3 RNAi使体外培养基质细胞中Mcm2基因沉默  41-42
    3.4 MCM2在小鼠子宫基质细胞蜕膜化过程中的作用  42-47
      3.4.1 Mcm2基因沉默减弱子宫基质细胞蜕膜化程度  42-43
      3.4.2 Mcm2基因沉默抑制基质细胞的增殖  43-45
      3.4.3 Mcm2基因沉默破坏基质细胞细胞周期稳定性  45
      3.4.4 Mcm2基因沉默引起蜕膜化中关键因子表达的下调  45-47
  4 结论  47-48
  5 展望  48-50
附录  50-54
参考文献  54-62
致谢  62

MCM2在小鼠子宫蜕膜化过程中作用的研究

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