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重组大流行流感灭活疫苗（家蚕杆状病毒）的检定

作　者: 廖必锋
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 禽流感疫苗家蚕杆状病毒 MALDI-TOF MS 免疫扩散疫苗检定
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

重组大流行流感疫苗(家蚕杆状病毒)是一种新型的基因工程禽流感疫苗。该疫苗是利用家蚕杆状病毒表面展示技术,将高致病性禽流感病毒A/Zhejiang/16/06(H5N1)株表面HA膜蛋白基因高效表达并将重组产物展示在家蚕杆状病毒的囊膜表面,形成表面携带HA胞外结构域的重组家蚕杆状病毒。该重组病毒经分离、纯化、灭活后制成禽流感疫苗,免疫实验动物后,能够产生有效的中和抗体,在Balb/c小鼠、新西兰大白兔、恒河猴动物试验中已经证实具有良好的安全性及免疫效果。因此,有望将该疫苗推向临床试验。该创新疫苗由于没有现成的国家标准,需要根据实际情况自行制定合适的质量标准。本研究根据SFDA关于新生物制品生产规范的相关要求,对该疫苗进行了检定,为制定合适的疫苗质量标准的提供参考。我们将疫苗毒种Bmgp64HA在家蚕BmN细胞中进行连续传代培养30代,并提取各代病毒的基因组DNA进行PCR鉴定。以融合基因上下游序列设计GP1和GP2一对引物进行扩增,结果发现1-10代病毒基因组的PCR结果均为阳性。DNA序列测定结果表明1-10代的病毒基因组中均含有完整的插入序列(GP-HA),与初始的GP-HA序列比对后未出现突变,可作为疫苗毒种工作种子批选定的参考。疫苗总蛋白的胰酶酶解样品经MALDI-TOF-MS进行肽质量指纹谱分析,通过高通量的肽质量指纹图谱对蛋白进行鉴定。结果发现,与HA蛋白序列匹配的肽段有7条,序列覆盖率为24%,这证明疫苗中含有HA蛋白,但是完成疫苗中HA全序列的鉴定还需要近一步的研究。血凝试验表明重组大流行流感疫苗(家蚕杆状病毒)表面的HA蛋白具有活性,可以发生血凝反应,血凝滴度达1:16。用HA特异性抗体对疫苗样品进行Western Blotting鉴定,结果出现3个条带。这与疫苗中的HA蛋白有HA、HA1和HA2这3种存在形式的预期相符。我们尝试用SRID法、DOT-BLOT法和间接ELISA法测定疫苗中HA的含量。在本研究中,SRID法和DOT-BLOT法不能测定该疫苗中的HA含量,间接ELISA法测得的疫苗中HA含量为4.6‰。该疫苗的HA含量测定方法还有待完善。疫苗样品经透射电镜观察证明病毒颗粒的形状。

重组大流行流感灭活疫苗（家蚕杆状病毒）的检定

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