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重组大流行流感疫苗的构建及制备工艺研究

作　者: 杨炳飞
导　师: 张耀洲；解纯刚
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 禽流感疫苗 区带离心 硫酸铵沉淀 超滤 透析
分类号: S852.52
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


禽流感是由A型流感病毒引起的鸟类感染性疾病,其中高致病性H5N1禽流感病毒可以在动物和人类中相互感染,且病死率极高。疫苗是预防禽流感的最主要的方法,而传统的禽流感疫苗的生产方式难以满足疫情爆发时的需求。我们首次应用家蚕杆状病毒表面展示技术高效表达禽流感病毒HA基因。首先利用杆状病毒载体pFastBacHTb作为转座载体,将gp64-HA基因转座到杆状病毒基因组(Bacmid)上,构建Bacmid-gp64-HA。然后通过脂质体将Bacmid-gp64-HA转染家蚕BmN细胞得到重组病毒vBmgp64-HA。以扩增后的重组病毒感染家蚕细胞,收集发病细胞,Western blotting和PCR分析结合血凝试验表明,gp64-HA基因在家蚕细胞中成功表达。可大规模获得重组杆状病毒,每头蚕蛹产量最高可达1 mg,这为研究并优化疫苗的生产工艺,生产出质量稳定可控的禽流感疫苗提供了保障。我们最初采用低速离心、高速离心、超速离心、区带离心分离纯化带囊膜的病毒,半成品比活达到206 u/mg,活性成分回收率为6.8%,但是对其进行SDS-PAGE和Western-Blotting时并没有发现相应的目的条带,分析实验结果发现,蚕蛹高达30%的油脂严重影响了病毒的分离效果,并造成了血凝试验的假阳性。我们采用30%饱和度硫酸铵溶液沉淀杂蛋白,并用60%饱和度硫酸铵溶液沉积病毒粒子代替超速离心,两者结合有效地使目的产物和油脂相分离,其中60%饱和度硫酸铵溶液沉积病毒粒子一步活性回收率高达88.9%,而且在改进生产工艺后,样品在SDS-PAGE和Western-Blotting分析时也出现了明显的目的条带,该工艺生产的半成品血凝滴度可以达到1:28,但是其蛋白浓度也达到了103 mg/mL,过多的杂蛋白导致超滤缓慢,过滤除菌也因样品透不过0.22μm膜而失败;为去除过多的杂蛋白,新工艺加入了对低速离心得到的上清经过10μm、0.45μm滤芯抽滤,再用两次区带离心代替一次区带离心的方法,最后的半成品采用透析脱糖的方法代替超滤脱糖,其中两次区带离心对病毒的分离和浓缩起到了很好的效果,其比活从第一次区带离心的34 u/mg提高到100 u/mg,而且第二次区带离心后回收的半成品的血凝滴度达到了1:24,其蛋白浓度只有3.2 mg/mL,比活可以达到100 u/mg,改进后的工艺,纯化明显,批次制备的样品质量稳定,为禽流感疫苗的大批量生产提供了可靠的依据。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-15
缩略语  15-16
第一章 禽流感疫苗研究进展  16-22
  引言  16
  1 禽流感病毒简介  16-17
  2 流感疫苗的类型  17-18
    2.1 全病毒疫苗  17
    2.2 裂解疫苗  17
    2.3 毒粒亚单位疫苗  17-18
  3 禽流感疫苗研究进展  18
  4 新型疫苗载体--昆虫杆状病毒载体  18-20
  5 疫苗制备及检测技术介绍  20-22
    5.1 区带离心  20-21
    5.2 血凝试验  21-22
第二章 实验方案设计  22-24
  1 研究目的和意义  22
  2 研究内容  22-23
  3 实验基本流程  23-24
    3.1 重组杆状病毒的构建  23
    3.2 禽流感疫苗制备工艺  23-24
第三章 重组病毒的构建  24-36
  1 材料与试剂  24-25
    1.1 材料  24
    1.2 试剂  24
    1.3 主要试剂配制  24-25
  2 实验方法  25-31
    2.1 细胞培养与冻存、复苏  25-26
    2.2 重组转移载体pFastBacHTb-gp64-HA 的构建  26-27
    2.3 重组Bacmid- gp64-HA 的构建  27-30
    2.5 重组Bacmid 通过脂质体介导法感染家蚕BmN 细胞  30
    2.6 重组病毒vBmgp64-HA PCR 鉴定  30
    2.7 重组蛋白gp64-HA 在家蚕BmN 细胞中的表达和鉴定  30-31
  3 结果与分析  31-35
    3.1 重组转移载体pFastBacHTb-gp64-HA 的鉴定  31-32
    3.2 重组Bacmid- gp64-HA 的 PCR 鉴定  32
    3.3 重组病毒vBmgp64-HA 的PCR 鉴定  32-33
    3.4 HA 蛋白在在家蚕细胞中的表达与鉴定  33-34
    3.5 HA 蛋白在在家蚕细胞中的血凝活性鉴定  34-35
  4 讨论  35-36
第四章 逐级离心生产工艺  36-44
  1 材料与试剂  36-37
    1.1 材料的获得  36
    1.2 试剂  36
    1.3 主要溶液配制  36-37
    1.4 实验设备  37
  2 方法  37-40
    2.1 实验前准备工作  37
    2.2 匀浆  37
    2.3 低速离心  37
    2.4 高速离心  37-38
    2.5 超速离心  38
    2.6 区带离心  38-39
    2.7 超滤除糖  39
    2.8 样品活性检测  39-40
    2.9 样品蛋白浓度测定  40
  3 结果与分析  40-42
    3.1 工艺各个步骤样品的血凝活性和蛋白浓度检测  40-42
  4 讨论  42-44
第五章 硫酸铵分级盐析分离油脂和杂蛋白工艺初探  44-51
  1 材料与试剂  44
    1.1 材料的获得  44
    1.2 试剂  44
  2 方法  44-47
    2.1 硫酸铵分级沉淀条件的摸索  44-46
    2.2 血凝试验  46
    2.3 SDS-PAGE 检测  46-47
    2.4 Western blotting 检测  47
  3 结果与分析  47-49
    3.1 样品血凝实验结果  47-49
    3.2 SDS-PAGE 检测、Western blotting 检测结果  49
  4 讨论  49-51
第六章 硫酸铵分级盐析分离油脂和杂蛋白工艺  51-63
  1 材料与试剂  51-52
    1.1 材料的获得  51
    1.2 试剂  51
    1.3 主要溶液配制  51
    1.4 实验设备  51-52
  2  52-56
    2.1 实验前准备工作  52
    2.2 匀浆  52
    2.3 低速离心  52
    2.4 高速离心  52
    2.5 硫酸铵分级沉淀蛋白  52-53
    2.6 超滤除盐  53
    2.7 区带离心  53-54
    2.8 超滤脱糖  54
    2.11 样品活性检测  54-55
    2.12 样品蛋白浓度测定  55
    2.13 SDS-PAGE 和Western blotting 检测  55-56
  3 结果与分析  56-61
    3.1 工艺各个步骤样品的血凝活性和蛋白浓度检测  56-61
  4 讨论  61-63
第七章 膜抽滤、两次区带离心去除杂蛋白工艺初探  63-68
  1 材料与试剂  63
    1.1 材料的获得  63
    1.2 试剂  63
  2 工艺摸索  63-64
    2.1 抽滤处理  63
    2.2 两次区带离心与一次区带离心比较  63-64
    2.3 超滤脱糖与透析脱糖比较  64
  3 结果与分析  64-66
  4 讨论  66-68
第八章 改进后的生产工艺  68-79
  1 材料与试剂  68-69
    1.1 材料的获得  68
    1.2 试剂  68
    1.3 主要溶液配制  68-69
    1.4 实验设备  69
  2 方法  69-74
    2.1 实验前准备工作  69
    2.2 匀浆  69
    2.3 低速离心  69
    2.4 高速离心  69-70
    2.5 硫酸铵分级沉淀蛋白  70
    2.6 超滤除盐  70
    2.7 第一次区带离心  70-71
    2.8 第二次区带离心  71-72
    2.9 透析除糖  72
    2.10 样品活性检测  72-73
      2.10.1 1%鸡红细胞悬液的制备  72
      2.10.2 血凝试验  72-73
    2.11 样品蛋白浓度测定  73
    2.12 SDS-PAGE 和Western blotting 检测  73-74
  3 结果与分析  74-78
    3.1 工艺优化效果分析  74-76
    3.2 工艺的稳定性实验分析  76-78
  4 讨论  78-79
第九章 基于家蚕多角体蛋白融合的Bm SMG9 蛋白高效表达及快速纯化研究  79-91
  1. 材料和方法  79-83
    1.1 材料  79-80
    1.2 方法  80-83
  2. 结果与分析  83-89
    2.1 生物信息学分析  83-85
    2.2 重组载体的构建  85
    2.3 重组蛋白的表达与纯化  85-86
    2.4 酶切后纯化结果  86-87
    2.5 TEV 酶酶切结果及鉴定  87-88
    2.6 酶切后目的蛋白的回收  88
    2.7 家蚕五龄幼虫各组织中BmSMG9 基因的荧光定量PCR 数据结果  88-89
  3. 讨论  89-91
总结  91-93
参考文献  93-98
致谢  98

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学 > 免疫法预防（接种）
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