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桔梗中皂苷的免疫佐剂活性研究

作　者: 谢勇
导　师: 李铎；孙红祥
学　校: 浙江大学
专　业: 食品安全
关键词: 桔梗皂苷溶血性佐剂活性 OVA rHBsAg 禽流感疫苗
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

桔梗为桔梗科（Campanulaceae）植物桔梗Platycodon grandiflorum （Jacq） A. DC.的干燥根。本课题应用现代色谱分离技术和免疫学方法,以溶血性与免疫佐剂活性评价为导向,从中药桔梗中分离出4个佐剂活性皂苷,采用多种光谱技术确定了化学结构。通过检测这4个皂苷的溶血性及对模式抗原卵清蛋白（OVA）的佐剂活性,探讨了桔梗酸类皂苷溶血性或免疫佐剂活性与化学结构之间的构效关系；评价了桔梗皂苷D （PlatycodinD, PD）和桔梗皂苷D2 （PlatycodinD2, PD2）对重组乙型肝炎表面抗原（recombinant hepatitis B surface antigen, rHBsAg）疫苗的佐剂效应和特点,以及Platycodin D对商品禽流感新城疫重组二联活疫苗的佐剂作用。1.桔梗总皂苷中免疫佐剂活性成分的分离与鉴定桔梗药材以70%乙醇回流提取,醇提取物经乙醚脱脂,以水饱和正丁醇萃取及大孔树脂纯化,得到桔梗总皂苷（PGS）. PGS通过硅胶柱色谱用CHCl₃/MeOH洗脱得到4个流份A、B、C和D,具有佐剂活性的流份C和D经过硅胶柱色谱、Rp-18柱色谱及凝胶柱色谱分离、纯化,得到化合物Ⅰ～Ⅳ。根据ESl-MS、HRESl-MS、H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、^AH-¹H COSY、HMQC及HMBC等多种光谱数据,这4个化合物分别鉴定为桔梗皂苷D、D2、D3和Platycoside E.2.四种桔梗皂苷的溶血性和对OVA.的佐剂活性及其构效关系采用比色法测定4个皂苷化合物对0.5%兔红细胞的溶血性。根据引起红细胞50%溶血浓度（HD50值）,这4个皂苷溶血性均显著低于QuilA （P＜O.001）,溶血性从大到小依次为PD>PD2>PD3>PE （P<0.01）。MTT法检测了4种桔梗皂苷对OVA受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。结果表明：4种皂苷均能促进ConA、LPS和OVA诱导的OVA受免小鼠淋巴细胞增殖反应（P<0.05.P<0.01或P<0.001）,其中PD的佐剂活性最显著,PE最弱,PD2和PD3介于二者之间。采用ELISA检测4种桔梗皂苷对OVA免疫小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及抗体亚类效价的影响。PD、PD2、PD3和Alum均能显著提高OVA免疫小鼠血清特异性IgG和IgGI效价（P<0.01或P<0.001）,且PD和PD2的佐剂活性显著优于Alum （P< 0.05或P<0.01）,而PE对OVA免疫小鼠血清中特异性IgG和IgGl效价无显著性影响。4种皂苷联合OVA免疫小鼠血清中特异性lgG2a和gG2b的效价也显著高于OVA单独免疫组,说明,这4种皂苷能显著促进OVA免疫小鼠Thl型免疫应答。4种桔梗皂苷化合物的溶血性和佐剂活性均随C3位糖链的糖基数增加而降低,同时,糖基的连接位置对溶血性和佐剂活性也有显著影响。3.桔梗皂苷PD和PD2对重组乙型肝炎表面抗原（rHBsAg）疫苗的佐剂作用PD和PD2分别联合rHBsAg免疫小鼠,二免后制备脾细胞悬液和分离血清,检测PD和PD2对rHBsAg免疫小鼠细胞免疫和体液免疫应答的影响评价。淋巴细胞增殖实验结果表明,PD和PD2可显著增强免疫小鼠T、B淋巴细胞对rHBsAg的免疫应答能力（P<0.05,P<0.01或P<0.001）。PD和PD2不仅能显著提高免疫小鼠血清中HBsAg特异性IgG抗体及其lgG1、IgG2a和IgG2b亚类抗体的效价（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,且抗体应答的佐剂活性效果显著优于Alum.表明PD和PD2对rHBsAg免疫小鼠细胞免疫和体液免疫应答均有显著的佐剂作用。PD能显著增强rHBsAg免疫小鼠自然杀伤细胞（NK）和抗原特异性细胞毒型T淋巴细胞（CTL）活性,表明PD可促进机体对靶细胞的非特异性和特异性杀伤能力。荧光定量PCR分析结果表明PD可增强Thl型细胞因子IL-2和IFN-γmRNA的表达（P<0.001）,从基因调控角度证实了PD能促进免疫小鼠对rHBsAg的Thl免疫应答,有利于诱导机体抗病毒细胞免疫功能。4.PD对禽流感新城疫重组二联活疫苗的佐剂作用与单独禽流感新城疫重组二联活疫苗免疫组对比,PD不仅能显著提高免疫小鼠血清中禽流感抗原特异性lgG, lgGl、lgG2a和IgG2b抗体效价,而且能显著促进ConA、LPS和特异性抗原诱导的免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应（P<0.05或P<0.01）。PD能显著促进免疫小鼠脾细胞Thl和Th2型细胞因子和转录因子INF-γ、、IL-10、T-bet和GATA-3基因表达（P<0.01）。说明PD对禽流感新城疫重组二联活疫苗有显著的佐剂作用,能同时诱导免疫小

全文目录

致谢  8-9
摘要  9-11
Abstract  11-14
主要缩略词  14-16
第一章综述部分  16-39
  第一节桔梗化学成分、生物活性研究进展  16-33
    一、化学成分研究  17-27
    二、桔梗的药理活性研究进展  27-33
  第三节疫苗的研究和免疫佐剂的使用  33-39
    1 疫苗作用于机体引起免疫应答的途径  33-34
    2 疫苗研究的发展和佐剂的使用  34-35
    3 几种类型常见的佐剂  35-38
    4 本课题研究背景、研究目的、研究内容  38-39
第二章桔梗皂苷免疫佐剂活性成分的分离与鉴定  39-52
  1. 材料和仪器  40-41
  2. 方法  41-44
  3. 结果与分析  44-50
    3.1 PGST及其各流份溶血性检测  44
    3.2 PGST及其流份对OVA受免小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚类的影响  44-46
    3.3 结构分析  46-50
  4. 讨论  50-51
  5. 小结  51-52
第三章四种桔梗皂苷活性化合物免疫佐剂活性构效关系研究  52-65
  1. 材料和仪器  53-54
  2. 方法  54-55
  3. 结果与分析  55-61
    3.1 PGS四个皂苷活性成分的溶血活性  55-56
    3.2 PGS四个皂苷活性成分对OVA受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响  56-58
    3.3 PGS四个皂苷对OVA受免小鼠血清中OVA特异性抗体及其亚类的影响  58-61
  4. 讨论  61-64
  5. 小结  64-65
第四章 PD和PD2对重组乙肝疫苗的佐剂作用特点研究  65-83
  1. 材料和仪器  66-68
  2. 方法  68-71
  3. 结果  71-79
    3.1 PD和PD2对rHBsAg受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响  71-73
    3.2 PD和PD2对rHBsAg受免小鼠血清中HBsAg特异性抗体及其亚类的影响  73-76
    3.3 桔梗皂苷D对rHBsAg疫苗受免小鼠NK细胞活性的影响  76
    3.4 PD对rHBsAg受免小鼠抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的影响  76-77
    3.5 桔梗皂苷D对免疫小鼠脾细胞因子IL-2和IFN-γmRNA表达的影响  77-79
  4 讨论  79-82
  5 小结  82-83
第五章桔梗皂苷D对禽流感新城疫二联活疫苗的佐剂活性研究  83-100
  1. 材料和仪器  85-86
  2. 方法  86-89
  3. 结果  89-96
    3.1 受免小鼠体重变化  89
    3.2 PD对禽流感新城疫重组二联苗受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响  89-91
    3.3 PD对AI(H5)+ND受免小鼠血清中H5特异性抗体效价的影响  91-94
    3.4 PD对受免小鼠脾细胞因子和转录因子表达的RT-PCR分析  94-96
  4. 讨论  96-99
  5. 小结  99-100
第六章结论及后续工作展望  100-101
参考文献  101-113
作者简介  113
附:攻读博士期间发表的文章  113-114
附图  114-126

桔梗中皂苷的免疫佐剂活性研究

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