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Hey1基因过表达对小鼠单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响

作　者: 许波
导　师: 张亚庆; 孙汉堂
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: Hey1 RAW264.7 破骨细胞 TRAP染色
分类号: R780.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 2次
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内容摘要

牙体吸收是由破骨细胞导致的牙体硬组织丧失。根管治疗是目前治疗牙体吸收的有效方法，但有时也难以达到彻底终止的疗效。牙体吸收如未被终止，则进一步发展，造成牙体硬组织全层的穿通，最终导致必须拔除患牙的后果。与骨吸收类似，破骨细胞作为唯一能在体内造成硬组织吸收的细胞，在牙体吸收过程中也发挥着主要作用。破骨细胞属于终末细胞，是由来自脾脏或骨髓的单核-巨噬细胞系的单核细胞前体融合而成的多核巨细胞。因此，控制单核细胞分化、融合形成破骨细胞从而有效控制破骨细胞的数量，就有可能减缓甚至终止牙体吸收的发生、发展。Notch是一种经典信号途径，对破骨细胞的发生发挥着重要的调控作用。Hey1是Notch信号途径的重要效应分子，但其在单核-巨噬细胞向破骨细胞分化过程中所起的具体作用尚不完全清楚。本实验通过建立Hey1基因过表达的RAW264.7细胞系，并观察Hey1基因在单核-巨噬细胞向破骨细胞分化过程中所起的作用，为进一步探索经由对Hey1的调控达到控制牙体吸收的发生发展的可能性打下基础。实验分为两个部分：1. Hey1基因过表达RAW264.7细胞系的建立目的：建立Hey1基因过表达RAW264.7细胞系，并对该细胞系进行鉴定。方法：对质粒进行扩增和提取，用Lipofectamine2000将Hey1表达质粒转染RAW264.7细胞系；预实验确定Blasticidin的筛选浓度，10μg／ml Blasticidin筛选稳定转染的细胞克隆，RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳实验检测Hey1基因表达水平。结果：经过长期筛选和多次传代后，细胞仍能在含有高浓度的blasticidin的培养液中生长良好，繁殖迅速；Blasticidin筛选出的细胞株Hey1mRNA表达水平显著高于正常RAW264.7细胞。结论：Hey1基因过表达RAW264.7细胞系建立成功。2. Hey1基因过表达对RAW264.7细胞向破骨细胞的分化能力的影响目的：观察Hey1基因过表达对小鼠单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响。方法：用50ng/ml的RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化，实时定量PCR检测破骨细胞标志物TRAP, Cathepsin K和RANK的表达变化；用50ng/ml的RANKL诱导RAW264.7细胞5天后进行TRAP染色，并对正常RAW264.7细胞和Hey1过表达RAW264.7细胞中的破骨细胞分别进行计数，结果用SPSS软件进行统计学分析。结果：在RANKL诱导下，正常RAW264.7细胞的TRAP、Cathepsin K表达量明显高于Hey1过表达的RAW264.7细胞，而Rank基因的表达量两者没有明显差异；在50ng/ml RANKL诱导条件下，Hey1过表达RAW264.7细胞分化形成的破骨细胞数显著低于正常RAW264.7细胞（P＜0.05）。结论：Hey1具有抑制小鼠单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化的作用。

Hey1基因过表达对小鼠单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响

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