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凝集素在绵羊种布鲁氏菌019株侵染小鼠巨噬细胞中的作用

作　者: 葛阳春
导　师: 陈创夫；王远志
学　校: 石河子大学
专　业: 基础兽医学
关键词: GSL基因 RAW264.7巨噬细胞 绵羊种布鲁氏菌019株 RNAi
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 26次
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内容摘要


目的：布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一类动物源性人兽共患病,在世界范围内广泛流行,尤其是发展中国家。布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生致病菌,该菌进入巨噬细胞后不但不被杀灭反而会被保护起来,这是布病不能治愈的主要原因。本文选择了与绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白互相作用的巨噬细胞的半乳糖特异性凝集素(galactose-specific lectin,GSL)基因,通过设计筛选shRNA片段干扰GSL基因的正常表达,通过用绵羊种布鲁氏菌019株进行侵染,进一步探讨GSL基因功能,为研究布鲁氏菌的胞内寄生机制奠定基础。方法：(1)由已发表的小鼠巨噬细胞GSL基因的核酸序列设计引物,根据RNAi设计原则,设计三条特异性阳性siRNA分子和一条阴性siRNA分子,构建shRNA表达载体,分别命名为pSI-LO, pSI-L17, pSI-L29, pSI-L34;(2)用构建好的shRNA表达载体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7及尾静脉注射BABL/C小鼠,应用实时定量PCR (Real-timePCR)评价其在小鼠巨噬细胞及小鼠体内表达的抑制作用,免疫组化法检测脾脏中GSL靶蛋白的存在；(3)用绵羊种布鲁氏菌019株侵染转染干扰载体前、后的RAW264.7巨噬细胞,用实时定量PCR、ELISA、电镜的方法,从基因水平、细胞因子、形态学三方面,检测布鲁氏菌内标基因16SrRNA的相对表达量、细胞上清中的细胞因子含量和巨噬细胞的形态变化,分析GSL基因在绵羊种布鲁氏菌019株侵染RAW264.7巨噬细胞中的功能。结果：经酶切图谱和序列测定证实,实验所构建的GSL基因shRNA表达载体中含有目的片段序列,上下游表达调控元件完备；经细胞水平检测转染500ng pSI-L17,pSI-L29,pSI-L34质粒能有效抑制目标基因在RAW264.7细胞中的表达,抑制率最高可达83.02%。小鼠实验中,尾静脉注射5μg上述不同siRNA分子对小鼠体内GSL基因的表达有一定的抑制作用,其抑制率在84%至96%之间,因此筛选出干扰效率最高的pSI-L34载体；免疫组织化学监测,证明干扰片段可以很明显的抑制小鼠的脾脏中GSL基因的表达。用019株在不同的时间段对转染了pSI-L34质粒的巨噬细胞侵染,随着侵染时间的加长,细菌进入细胞的个数明显增加,说明GSL基因与布鲁氏菌感染RAW264.7细胞相关；用细胞因子试剂盒检测细胞上清中的细胞因子含量可以看出,炎性细胞因子IL-6、TNF-a的变化出现了炎性症状；用电镜观察可以看出细胞出现明显的肿胀,说明当GSL基因沉默后用019株进行侵染,巨噬细胞出现了坏死现象。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-10
符号、缩略语对照表  10-12
前言  12-13
第一章 文献综述 RNA干扰及其应用研究  13-20
  1 RNA干扰现象  13
  2 RNAi的机制  13-14
  3 RNAi的特点  14-15
  4 RNAi的功能  15-16
    4.1 抗病毒功能  15
    4.2 功能基因组学研究  15-16
    4.3 基因调控  16
  5 RNAi的应用与前景  16-18
    5.1 高通量的研究基因功能  16-17
    5.2 基因敲除  17
    5.3 基因治疗  17
    5.4 基因表达调控  17-18
  参考文献  18-20
第二章 试验部分  20-61
  实验一 小鼠巨噬细胞GSL基因shRNA表达载体的构建  20-32
    1 材料和方法  20-24
      1.1 材料  20-21
      1.2 方法  21-24
    2 结果  24-28
      2.1 靶序列的siRNA的合成  24-25
      2.2 重组质粒的克隆与酶切  25-26
      2.3 序列的测定  26-28
    3 讨论  28-31
      3.1 siRNA制备与筛选  28-29
      3.2 重组质粒的鉴定方法  29
      3.3 RNAi技术的展望与存在的问题  29-31
    参考文献  31-32
  实验二 载体表达的siRNA分子对小鼠巨噬细胞galactose-specific lectin基因表达的抑制作用  32-47
    1 材料与方法  32-38
      1.1 材料  32-33
      1.2 方法  33-38
    2 结果  38-45
      2.1 小鼠巨噬细胞总RNA的提取  38-39
      2.2 GSL基因和GAPDH基因的克隆结果  39-40
      2.3 GSL基因和GAPDH基因的测序结果  40-41
      2.4 GSL基因和GAPDH基因的标准曲线  41-42
      2.5 细胞转染结果观察  42
      2.6 shRNA重组质粒干扰效果的检测结果  42-44
      2.7 免疫组织化学检测靶蛋白的表达  44-45
    3 讨论  45-46
      3.1 小结  45
      3.2 免疫组化化学注意事项  45-46
    参考文献  46-47
  实验三 GSL基因在绵羊种布鲁氏菌019株侵染RAW264.7细胞过程中的功能分析  47-61
    1 材料与方法  48-51
      1.1 材料  48
      1.2 方法  48-51
    2 结果  51-58
      2.1 16SrRNA PCR扩增结果  51-52
      2.2 16SrRNA质粒PCR鉴定结果  52
      2.3 16SrRNA实时定量的标准曲线  52-53
      2.4 绵羊种布鲁氏菌019株侵染RAW264.7细胞cDNA的检测结果  53
      2.5 绵羊种布鲁氏菌019株侵染RAW264.7细胞荧光定量的检测结果  53-54
      2.6 细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α的检测结果  54-57
      2.7 绵羊种布鲁氏菌019株侵染RAW264.7细胞电镜结果  57-58
    3 讨论  58-60
      3.1 布鲁氏菌与宿主细胞的关系  58
      3.2 沉默GSL基因在布鲁氏菌感染巨噬细胞时细胞因子表达的变化  58-59
      3.3 布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞过程中GSL基因功能的初步分析  59-60
    参考文献  60-61
结论  61
创新点  61-62
附录  62-63
致谢  63-64
作者简介  64-65
导师评阅表  65

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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