学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

rhIGF-1对成骨细胞和破骨细胞相互作用的调节作用

作　者: 任玉平
导　师: 张镜宇
学　校: 天津医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 重组人胰岛素样生长因子1 成骨细胞破骨细胞 ELISA 实时荧光定量PCR
分类号: R580
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 43次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的在成骨细胞(ostelblast, OB)及破骨细胞(Osteoclast, OC)的表面均表达有胰岛素样生长因子1 (insulin like growth factor 1,IGF-I)的受体,IGF-I对这两种细胞也都具有激活作用。IGF-1在调节骨代谢平衡中具有重要作用,被认为是存在于RANKL/OPG系统之上,调节成骨细胞与破骨细胞相互作用的核心分子。为此,本文拟探讨不同浓度的rhIGF-I对成骨细胞和破骨细胞的直接作用,及对成骨细胞和破骨细胞相互作用的调节。方法1.利用50ng/ml的RANKL诱导小鼠破骨前体细胞系分化为成熟破骨细胞。TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶染色)鉴定。2.以50ng/ml rhIGF-I分别干预成细胞以及分化成熟的破骨细胞,干预时间分别为：6min、20min、60min; Western-blotting检测rhIGF-1R活化情况。3.分别加入0、2、4、6ug/ml的兔抗rhIGF-I IgG中和培养基中的rhIGF-I,利用Western-blotting进行抗体中和浓度的筛选。4.重新接种成骨细胞和破骨细胞,用0、10、50、100ng/ml的rhIGF-1分别干预成骨细胞、破骨细胞,12小时后终止培养并收集培基,之后实验分为三组：A组：rhIGF-1直接干预组。B组：条件培养基交互培养组：破骨细胞经rhIGF-1干预后的条件培养基(OC conditioned medium after rhIGF-1 treatment, OCCM);成骨细胞经rhIGF-1干预后的条件培养基(OB conditioned medium after rhIGF-1 treatment, OBCM)。滤过OCCM、OBCM后两细胞培基互换交互培养12h。C组：rhIGF-1中和后交互培养组：OCCM、OBCM中加入4g/ml的抗rhIGF-I IgG,中和后再用于交互培养12h。(1) ELISA检测各组OB上清液中RANKL、OPG及BGP含量。(2)实时荧光定量PCR检测各组OB中Bgp、Opg、Rankl及OC中Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平。结果1.50ng/ml的RANKL诱导培养8天后,RAW264.7出现TRAP阳性多核细胞。2. 50ng/ml rhIGF-I分别干预成骨细胞、破骨细胞6、20、60mmin后,Western-blotting检测随着rhIGF-1干预时间的延长磷酸化rMGF-1R的量逐渐增加,而未磷酸化rhIGF-1R逐渐减少。3.未加rhIGF-1干预空白对照组无磷酸化rhIGF-1R; rhIGF-1干预后可以检测到大量磷酸化rhIGF-1R; rhIGF-1干预后培基中加入2ug/ml抗体中和后可检测到少量磷酸化rhIGF-1R,而加入4、6ug/ml的抗体中和后未检测到磷酸化rhIGF-1R。同时随着中和抗体浓度的增加,非磷酸化IGF-IR也增加。4.(1)当rhIGF-1单独干预成骨细胞时,测定上清液中RANKL、OPG及BGP含量,结果显示不同浓度的IGF-1对成骨细胞合成RANKL、OPG及BGP无影响；而当用OCCM及抗体中和后的OCCM培养成骨细胞时,发现三种细胞因子在上清液中的含量均在rhIGF-1初始干预浓度为10、50ng/mL时明显高于其他组,并以低剂量组——即rhIGF-1初始浓度为10ng/mL时最高。同时,当用抗体中和后的OCCM培养成骨细胞时,三种细胞因子在上清液中的表达在低剂量组明显高于OCCM培养的成骨细胞组。(2)实时荧光定量PCR检测结果显示rhIGF-1直接干预OB、OC时,OB中Bgp、Opg、Rankl及OC中Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平在不同剂量组与未加rhIGF-1干预的空白组之间无明显差别；而OCCM与抗体中和后OCCM培养的OB组及OBCM与抗体中和后OBCM培养的OC在rhIGF-1干预浓度为10ng/ml时j3gp、Opg、Rankl及Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平显著高于空白组与其他剂量组,统计学分析表明前者与其它各组表达水平存在显著差异(p<0.05)。结论综合上述各项指标的检测结果显示,rhIGF-1直接干预成、破骨细胞时作用不明显；当有另一细胞参与后,各项检测指标的变化均非常显著,以低剂量组最为明显,但不是剂量依赖性。鉴于rhIGF-1已经被证实有显著的体内促成骨活性,因此本研究推测rhIGF-1在对成骨细胞的刺激上可能首先作用于破骨细胞,引起破骨细胞及其活动微环境的改变,进而影响到成骨细胞的生长和功能；同理对破骨细胞也是一样,要先作用于成骨细胞引起成骨细胞及其活动微环境的改变,进而影响到破骨细胞的生长和功能。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语  10-12
前言  12-15
  研究现状、成果  12-14
  研究目的、方法  14-15
1 对象和方法  15-26
  1.1 对象  15-16
  1.2 方法  16-26
2 结果  26-46
  2.1 细胞爬片TRAP染色结果  26
  2.2 Western-blotting鉴定成、破骨细胞中rhlGF-1R的磷酸化情况  26-27
  2.3 Western-blotting鉴定抗重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(rhIGF-Ⅰ)抗体的中和作用  27-28
  2.4 骨钙素(bone Gla protein,BGP)检测—竞争性抑制法酶联免疫吸附测定结果  28-29
  2.5 RANKL检测—竞争性抑制法酶联免疫吸附测定结果  29-30
  2.6 OPG检测—双抗体夹心酶联免疫吸附测定结果  30
  2.7 成、破骨细胞总RNA的提取  30-31
  2.8 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增结果及测序结果  31-35
  2.9 荧光定量PCR检测待测基因表达水平  35-46
3 讨论  46-52
  3.1 RANKL诱导小鼠单核细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞  46-47
  3.2 重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(rhlGF-Ⅰ)干预成、破细胞及其中和抗体剂量筛选  47
  3.3 rhIGF-Ⅰ对成骨细胞与破骨细胞间相互作用的调节作用  47-52
结论  52-53
参考文献  53-58
发表论文和参加科研情况说明  58-59
综述 IGF-Ⅰ与骨代谢  59-71
  综述参考文献  67-71
致谢  71

rhIGF-1对成骨细胞和破骨细胞相互作用的调节作用

内容摘要

全文目录

相似论文