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天花粉蛋白对结肠癌SW-620细胞株增殖、黏附和迁移的实验研究

作　者: 熊高准
导　师: 楼建国
学　校: 浙江大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 天花粉蛋白细胞凋亡细胞周期细胞黏附细胞迁移 SW-620细胞
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

[研究背景]结肠癌目前是我国继肺癌、胃癌、肝癌后第4位常见的肿瘤。随着生活水平的提升、饮食结构的改变,结肠癌的发病率明显升高,目前手术切除仍是主要的治疗方案,但仍有相当多的患者在手术时发现已通过血行转移至肝、肺等。肿瘤在本质上是基因病。其发病由多方面因素决定,外源性因素包括物理、化学、生物等,内源性因素包括遗传、免疫、精神等。各种内外源性的因素以协同或序贯的方式引起细胞癌变,从而激活原癌基因和(或)灭活肿瘤抑制基因,加上凋亡调节基因和(或)DNA修复基因的改变,继而引起蛋白表达水平的异常,其中活性氧自由基(ORS)在肿瘤的发生过程中起到推波促澜的作用。肿瘤细胞的增殖与调亡调控的失调导致肿瘤细胞的无限增殖,其与组织基质黏附改变及自身生物学特性导致肿瘤细胞的转移。目前的常用抗肿瘤药的主要机理主要也是这些。传统中医学认为,肿瘤的发生的病因不外内伤和外伤病因,内伤病因涉及到人体正气的虚弱及情志因素的变化,外伤因素涉及到饮食、环境、地域、虫毒及致病邪气等。目前,中医对肿瘤的病机主要概括为气滞血瘀、痰湿凝聚、热毒内蕴、脏腑失调、正气虚弱,法随证立,临床上中医对肿瘤的治疗大法也主要是活血化瘀、化痰祛湿、清热解毒、扶正固本等,常用的中药有活血化瘀药、祛痰化湿药、清热解毒药、补虚药。这些中药中有很多药物都有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,比如紫三醇、三氧化二砷等。天花粉(Trichosanthes Kirilowii Maxim)为葫芦科植物栝楼的根,是临床上常用的中药,具有清热泻火,生津止渴,排脓消肿等作用。天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS)是从天花粉中提取的一种Ⅰ型核糖体灭活蛋白(ribosome-inactivatingprotein, RIPs),由247个氨基酸残基组成,分子量约为27610,具有N-糖苷酶活性。天花粉蛋白临床用于引产及异位妊娠已有多年的经验,但最近的一些药理研究发现其还有多种其他的药理活性,如抗HIV,抗肿瘤等作用,而其抗肿瘤作用是当前研究的重点,但主要集中在宫颈癌、绒毛膜癌等肿瘤,而肠癌研究方面报道较少,本实验选择具有高度转移性的人结肠癌SW-620细胞株,通过体外试验来观察TCS.对人结肠癌细胞株SW-620细胞株的增殖、黏附和迁移作用,并初步探讨其机制。[研究目的]为研究天花粉蛋白(TCS)对结肠癌SW-620细胞株增殖、黏附和迁移的影响,以具有高度转移性的人结肠癌SW-620细胞株为研究对象,观察天花粉蛋白对SW-620细胞株的生长增殖及凋亡的影响,并探讨天花粉蛋白对SW-620细胞株迁移及与其人脐静脉内皮细胞(HUVEC)黏附作用的影响。[研究方法]1.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测TCS对SW-620细胞增殖抑制作用。2. Hoechst33258荧光染色法观察TCS诱导SW-620细胞凋亡的形态变化。3. Annexin V-PI双染法检测TCS对SW-620细胞的早期凋亡作用,PI单染法检测TCS对SW-620细胞周期的影响。4.划痕实验观察TCS对SW-620细胞迁移作用。5.血管内皮细胞黏附试验检测TCS对SW-620细胞与HUVEC细胞黏附作用影响。[研究结果]1.TCS对SW620和细胞的生长抑制作用：MTT结果表明,与对照组相比,TCS对SW620生长抑制作用明显,且呈时间和剂量依赖性。实验组分别经0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml TCS处理24、48、72h后,SW620细胞生存率均随着TCS浓度的提高逐渐下降,生长均不同程度地受到抑制,且呈时间和浓度依赖性,24、48、72h的IC50为56.8、33.96、22.18μg/ml,除0.625μg/ml在24h与对照组无相比差异外,其他浓度组都有统计学差异(P<0.05)。2.Hoechst33258荧光染色法观察经过TCS处理后的SW-620细胞的形态变化经过20、40μg/mlTCS作用48h后,可在荧光显微镜下看见凋亡的细胞,凋亡的细胞核体积缩小,核染色质聚集,有碎片样凋亡小体的出现,而对照组则未见到此现象。3.流式细胞术显示：SW-620对照组早期凋亡率为(0.77±0.75)%,而经过20、40μg/ml TCS处理细胞48h后,细胞的早期凋亡率分别是(3.53±1.07)%、(6.7±0.5)%,结果与对照组相比,20μg/ml的TCS无明显诱导SW-620细胞的早期凋亡作用(P>0.05),而40μg/ml的TCS则具有诱导SW-620调亡的作用(P<0.05)。对照组S期的比例分别为25.15%,G1期比例分别为64.56%,经过20、40μg/mlTCS作用48h后,S期比例分别升高到32.19%、58.09%,G1期分别比例下降为59.21%、33.91%, G2/M期无显著变化。结果提示,TCS能将SW-620细胞阻滞在S期,作用呈浓度依赖性。4.血管内皮细胞的黏附试验：血管内皮细胞的黏附实验结果显示,经不同浓度的TCS处理48h后的SW-620细胞与HUVEC细胞共培养2h后,与对照组相比,细胞黏附率均下降,其中20μg/ml和40μg/ml与对照组相比,P值分别为P=0.03和P=0.01,具有统计学意义。5.划痕实验检测TCS对SW-620的迁移的影响：24、48h阴性对照组迁移距离为(154.8±18.3)、(222.0±12.2)像素,经2.5μg/mlTCS共同培养24、48h后,其迁移距离分别为(58.40±15.7)、(97.0±16.4)像素,与对照组相比,2.5μg/mlTCS能抑制SW620的迁移(P<0.01)。[结论]1.不同浓度天花粉蛋白能够抑制SW-620细胞增殖,抑制作用呈的剂量时间效应关系。2. Hoechst33258荧光染色法显示天花粉蛋白能够诱导SW-620细胞凋亡,呈特征性的细胞凋亡形态；3.天花粉蛋白能促进SW-620细胞的早期凋亡,能将其细胞周期阻滞在s期。4.天花粉蛋白能够抑制SW-620细胞与血管内皮细胞之间黏附。5.天花粉蛋白能够抑制SW-620细胞的迁移运动。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-9
Abstract  9-14
英文缩略词  14-15
目录  15-16
引言  16-19
1 材料与方法  19-23
  1.1 实验材料  19-21
  1.2 实验方法  21-23
2 实验结果  23-30
  2.1 天花粉蛋白对SW-620细胞增殖抑制的作用  23-24
  2.2 Hoechst33258荧光染色法观察天花粉蛋白诱导SW-620细胞的调亡  24-25
  2.3 流式细胞术检测天花粉蛋白对SW-620细胞早期凋亡及细胞周期  25-27
  2.4 SW-620细胞与血管内皮细胞的黏附试验  27-28
  2.5 划痕实验检测TCS对SW-620的迁移的影响  28-30
3 讨论  30-32
4 结论  32-33
参考文献  33-35
综述  35-43
  参考文献  41-43
作者简历及所取得的科研成果  43

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