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雷公藤红素抑制脑胶质瘤干细胞转分化血管内皮样细胞的实验研究

作　者: 曹广辉
导　师: 周幽心
学　校: 苏州大学
专　业: 神经外科学
关键词: 脑胶质瘤干细胞 转分化 血管内皮样细胞 雷公藤红素 细胞凋亡 细胞周期
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目前,脑胶质瘤干细胞理论越来越被广大学者所接受,脑胶质瘤干细胞（brain glioma stem cells, BGSCs）是脑胶质瘤的种子细胞,具有自我更新增殖和多向分化潜能等干细胞属性,是近年来研究的热点。目前国内外对于脑胶质瘤干细胞转化为其亲本表型细胞即胶质瘤细胞研究较多,而对于BGSCs能否转分化为血管内皮样细胞（vascular endothelial cell-like cells）,参与肿瘤血供却研究较少,因此我们通过体外一定条件下转分化脑胶质瘤干细胞并应用雷公藤红素抑制其转化过程进行研究。本课题从两个方面对脑胶质瘤干细胞进行研究:①脑胶质瘤干细胞在体外一定条件下转分化为血管内皮样细胞。②各种不同浓度雷公藤红素对于转分化过程的抑制作用。第一部分脑胶质瘤干细胞转分化血管内皮样细胞目的探索在体外一定条件下脑胶质瘤干细胞转分化为血管内皮样细胞的可行性,为进一步研究雷公藤红素对此转分化过程的抑制作用奠定基础。方法将脑胶质瘤干细胞培养于无血清的干细胞培养液,观察细胞形态变化,传代后行CD133、Nestin、CD31和KDR免疫荧光染色。并且传代后将脑胶质瘤干细胞分为实验组和对照组,实验组用含有DMEM/F12基础培养液100ml, 10%FCS, VEGF 20ng/ml, EGF 20ng/ml,bFGF 20ng/ml, 1/100 N2的转分化培养基在含有0%O2, 5%CO2, 10%H2和85%N2的厌氧培养条件下培养;对照组用仅含有DMEM/F12基础培养液100ml, 10%FCS的普通培养基在有氧条件下培养,镜下观察细胞形态变化。细胞培养12天后将实验组及对照组细胞收集予以CD31、KDR免疫荧光染色,种植在Matrigel胶上观察细胞生长形态变化。结果脑胶质瘤干细胞在干细胞培养基中悬浮生长,CD133和Nestin免疫荧光染色阳性, CD31、KDR免疫荧光染色呈阴性。实验组脑胶质瘤干细胞转分化培养12天后镜下可见铺路石样结构,CD31、KDR免疫荧光染色呈阳性,种植于Matrigel胶上呈管状结构。而对照组细胞在普通条件下培养12天后未见明显铺路石样结构,CD31、KDR免疫荧光染色呈阴性表现,种植于Matrigel胶上未见明显管状结构。结论脑胶质瘤干细胞在体外厌氧条件下应用转分化培养基培养12天后可转分化为血管内皮样细胞。第二部分雷公藤红素抑制脑胶质瘤干细胞向血管内皮样细胞转分化目的研究各种不同浓度雷公藤红素对于脑胶质瘤干细胞的抑制作用以及对于脑胶质瘤干细胞转分化为血管内皮样细胞过程的作用机制。方法一部分脑胶质瘤干细胞在厌氧罐中转分化72小时后加入0.04μg/ml,、0.2μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、25.0μg/ml、125.0μg/ml等不同浓度雷公藤红素,在药物作用48小时后弃除雷公藤红素溶液,换用转分化培养基继续转分化7天后观察细胞形态改变,行CD31、KDR免疫荧光染色。另一部分脑胶质瘤干细胞种植于Matrigel胶上,重复以上步骤加入不同浓度雷公藤红素,观察转分化过程中有无小管样结构形成。脑胶质瘤干细胞在厌氧罐中转分化72小时后加入0.04μg/ml、0.2μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、25.0μg/ml、125.0μg/ml等不同浓度雷公藤红素,在药物分别作用24、48小时后MTT法检测细胞生长抑制情况;在药物作用48小时收集细胞,AnnexinⅤ-PI法检测细胞凋亡情况,细胞周期检测试剂盒检测细胞周期改变,半定量RT-PCR法检测caspase-3的表达情况。结果仅0.04μg/ml药物作用组细胞在继续转分化7天后细胞出现铺路石样改变,CD31,KDR免疫荧光染色阳性,在Matrigel胶上可见小管样结构形成, 0.2μg/ml药物作用组细胞在Matrigel胶上偶见个别小管形成,而其他药物组细胞未见铺路石样改变,行CD31和KDR的免疫荧光染色为阴性结果,Matrigel胶上未见明显小管样结构形成。在一定的浓度范围内,随着雷公藤红素浓度的增加,MTT法提示药物对于脑胶质瘤干细胞的抑制作用越强;AnnexinⅤ-PI法检测提示细胞的凋亡越明显;细胞周期检测提示G1期细胞数量百分比逐渐减少,而S期细胞百分比逐渐增多;半定量RT-PCR法caspase-3的表达越明显。结论雷公藤红素在一定浓度范围内可明显抑制脑胶质瘤干细胞的生长及向血管内皮样细胞转分化。并存在时间剂量依赖性。雷公藤红素抑制脑胶质瘤干细胞向血管内皮样细胞转分化的机制可能与诱导干细胞凋亡及将转分化的干细胞阻滞于S期有关。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-11
引言  11-14
  参考文献  13-14
第一部分 脑胶质瘤干细胞转分化血管内皮样细胞  14-25
  材料与方法  14-18
  结果  18-20
  讨论  20-22
  结论  22-23
  参考文献  23-25
第二部分 雷公藤红素抑制脑胶质瘤干细胞向血管内皮样细胞转分化  25-47
  材料与方法  25-30
  结果  30-41
  讨论  41-45
  结论  45-46
  参考文献  46-47
综述  47-58
  参考文献  54-58
中英文对照缩略词表  58-59
攻读学位期间公开发表的文章  59-60
致谢  60-61

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 神经系肿瘤
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