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SV40T转基因小鼠胃粘膜癌变机理的研究

作　者: 赵君亮
导　师: 张钦宪
学　校: 郑州大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: Cyclin D1 Rb SV40T 小鼠转基因动物
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猴空泡病毒40(SV40),是一种DNA病毒,SV40Tag是SV40中调节细胞周期的重要蛋白,在体外可使人以及动物的多种组织的正常细胞发生恶性进展,常应用于转基因动物模型的制作,在转基因动物体内可诱发多种肿瘤形成。体外的细胞培养结果都说明SV40T抗原有助于致癌基因的转化。T抗原作用于抑癌基因Rb和wp53,使Rb、wp53分别与SV40T上的Rb结合域、p53结合域结合,从而使Rb、wp53丧失抑癌蛋白的作用,而解除了它们对细胞周期的控制,使细胞加速分裂、无限生长,进而导致肿瘤的形成。在大多数情况下,T抗原通过诱导Rb蛋白的失活(pRB, p130,p107)进入细胞周期,从而激活E2F依赖的转录和随后进入S期。同时,T抗原阻止wp53的活性,从而可防止随之而来的纸胞周期停滞和细胞凋亡。在前期研究中,本课题组利用显微注射法制备了胃壁细胞特异性表达SV40T抗原的转基因小鼠,得到了2#、4#、8#、16#、24#、51#、57#、61#、68#和73#等十个品系的G0代转基因阳性小鼠,经过九代的传代培养,SV40T基因已经在小鼠体内可以稳定遗传和表达。并发现转基因阳性小鼠胃粘膜均有增生。为了研究胃粘膜从增生至癌变的发生机理,我们利用已建立的胃壁细胞特异性表达SV40Tag的转基因小鼠模型,月RT-PCR和Western blotting等实验技术对24#品系转基因小鼠(胃粘膜增生)和73#品系转基因小鼠(胃粘膜癌变)中Rb基因及其通路主要成员E2F-1,Cyclin D1和CDK4的表达水平进行了研究,探讨SV40Tag和Rb在胃粘膜癌变过程中的作用及机制。方法：1.用HE染色对6只24#品系雄性转基因小鼠、6只73#品系雄性转基因小鼠和6只正常雄性小鼠的脾、肺、肝脏、小肠、大肠、睾丸、胃等组织染色观察小鼠各个器官的病理学变化。2.用RT-PCR对6只24#品系雄性转基因小鼠、6只73#品系雄性转基因小鼠和6只正常雄性小鼠检测Rb基因及其通路相关基因(E2F-1、Cyclin D1和CDK4)在胃粘膜和睾丸中mRNA水平表达。3.应用Western blotting技术对6只24#品系雄性转基因小鼠、6只73#品系雄性转基因小鼠和6只正常雄性小鼠检测Rb基因及其通路相关基因(E2F-1、Cyclin D1和CDK4)在胃粘膜和睾丸中蛋白水平表达的差异。4.用免疫组织化学染色方法对6只73#品系雄性转基因小鼠的睾丸进行抗SV40Tag的抗体检测。结果：1.HE染色的结果显示,在24#品系雄性转基因小鼠的病理切片中可以看到小鼠的胃粘膜发生了明显的增生,成熟壁细胞的数量减少,73#品系雄性转基因小鼠胃粘膜出现了早期癌变的症状,而且其睾丸的病理切片显示了其发生了癌变。7RT-PCR的结果显示,在SV40Tag存在的情况下,Rb基因在mRNA水平的表达与正常组织相比,显著降低,P<0.05；而Rb通路相关基因E2F-1、CyclinD1及CDK4等mRNA水平的表达显著提高,P<0.05。3.Western blotting的结果显示,在SV40Tag存在的情况下,Rb基因在蛋白水平的表达与正常组织相比,显著降低,P<0.05；而Rb通路相关基因E2F-1、蛋白水平的表达显著提高,P<0.05；Cvclin D1及CDK4蛋白水平的表达没有检测出来。4.免疫组织化学的结果显示,在73#品系转基因小鼠的睾丸部位检测到了SV40Tag的表达。结论：1SV40Tag转基因小鼠通过SV40Tag-下调Rb基因的RNA和蛋白的表达,而上调Rb通路相关基因E2F-1、Cyclin D1和CDK4的RNA和E2F-1蛋白的表达,提示SV40Tag可能通过抑制Rb抑癌基因的信号途径而参与此转基因小鼠的癌变模式。2.73#品系转基因小鼠睾丸的癌变与SV40Tag的表达有关。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-10
前言  10-12
材料与方法  12-27
结果  27-34
讨论  34-38
结论  38-39
下一步的工作和建议  39-40
参考文献  40-43
综述  43-57
  参考文献  53-57
英文缩略词  57-58
致谢  58-59
个人简历  59

SV40T转基因小鼠胃粘膜癌变机理的研究

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