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目的体外培养、纯化大鼠脑皮质星形胶质细胞,获得高纯度的星形胶质细胞培养物,观察其生长过程及其生物学特性,采用脂质体方法将含有目的基因SV40T的质粒pSV3neo转入纯化的星形胶质细胞内,为后续创建永生化星形胶质细胞株作准备,并为研究不同发育时期星形胶质细胞的生物学特性等奠定基础。方法胰酶消化结合机械吹打方法分离大鼠脑皮质细胞,差速粘附处理及恒温摇床振荡法获得纯化星形胶质细胞,经含SV40T基因的质粒pSV3neo脂质体转染法转入星形胶质细胞,SV40T抗原免疫荧光染色后检测转染结果。1.星形胶质细胞的纯化培养及形态学观察：取新生Wistar大鼠大脑皮质,用胰酶消化结合机械吹打方法制成初细胞悬液,差速贴壁法去除成纤维细胞,培养至细胞融合并分层生长时,以恒温摇床振荡方法去除神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞等继续培养,获得纯化星形胶质细胞,并用GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。倒置相差显微镜下观察培养不同时间的细胞密度、突起长度及分支情况等并进行体视学测量以了解细胞的生长状态。2.质粒抽提及鉴定：质粒pSV3neo转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经37℃振荡培养扩增后,用质粒抽提试剂盒抽提质粒,所提质粒进行酶切后电泳分析,采集图像与质粒说明书比对,鉴定正确后大量扩增,用于后续转染实验。3.质粒转染：纯化后细胞生长1-2 d,其融合度分别达80%、90%接种密度时,以3.0、4.0、5.0、6.0μl/50μl四种脂质体浓度和0.4、0.8、1.2、1.6μg/50μl四种质粒浓度组合后,混合于培养物中进行转染,SV40T抗原免疫荧光染色标记后检测,以阳性标记细胞率最高的细胞接种密度、脂质体浓度和质粒浓度,作为最终转染条件,进行规模转染。4.转染细胞的观察：倒置相差显微镜下,观察转染过程中及转染后细胞的形态及生物学特性改变,比较转染细胞与未转染细胞的差异；免疫荧光染色方法检测SV40T抗原及GFAP在转染后细胞中的表达情况。结果1.培养细胞的生长规律：分离的大鼠脑皮质细胞在接种后1h开始贴壁,6-8 h后大部分细胞已贴壁,呈椭圆形、梭形及不规则形,部分细胞已开始铺展,并长出突起。随着培养时间的延长,细胞数量增多、体积增大,突起延长且数目增加,3-5 d时增加最明显。培养7～10d后,细胞已融合并可见分层生长,底层为星形胶质细胞,上层为神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞等其它细胞。2.纯化鉴定：根据细胞分层生长的特性,经摇床振荡处理后,显微镜下可见贴壁细胞形态较一致,胞体轮廓清晰,一级胞突丰富,分支较多,相互交织成网状；纯化后的细胞经GFAP免疫细胞化学染色后,阳性细胞胞浆及突起均呈棕色,星形胶质细胞纯度达98%以上,可用于后续实验。3.质粒鉴定：质粒转化感受态细胞,经扩增、抽提后,酶切电泳,可清晰见到4条带,与1Kb DNA Ladder比对,分子量对应于4.6、3.1、1.4、0.64 kbp,证明所提质粒为所需质粒pSV3neo。4.转染优化试验：经脂质体、质粒浓度及细胞接种密度的转染优化试验,可得细胞融合度约90%时,以5.0μl/50μl脂质体,1.2μg/50μl质粒转染后,经免疫荧光染色可见较多阳性细胞,从而确定为转染最佳条件。5.转染细胞观察：铺板细胞达到一定融合度后,加入质粒与脂质体的混合物,作用约5h时,显微镜下观察可见细胞胞体和突起肿胀,细胞轮廓清晰,立体感增强；48 h后观察可见部分细胞裂解死亡,存活细胞形态变化不大；经免疫荧光染色后,胞浆内呈现GFAP红色荧光,清晰显现出细胞轮廓,并可见SV40T绿色荧光。结论1.原代培养的大鼠脑皮质细胞在培养3～5 d时增殖最明显,细胞数目增加,体积增大,突起增多延长并相互交织成网状；约7～10d细胞融合并分层生长时进行恒温摇床振荡传代处理,所得星形胶质细胞纯度可达98%以上。2.通过转染优化试验,可以确定转染的最佳条件为：24孔板细胞融合度约90%,脂质体5.0μl/50μl和质粒1.2μg/50μl。优化条件确定后,转染实验可以根据培养板表面积增加的比例线性放大,扩大转染量,并用于后续永生化细胞株的筛选。3.含目的基因SV40T的质粒pSV3neo转染纯化的星形胶质细胞后,免疫荧光染色检测到SV40T在星形胶质细胞内的表达产物SV40T抗原,转染成功。
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