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靶向hTERT的特异性siRNA抑制前列腺癌PC-3细胞增殖机制研究

作　者: 王宁
导　师: 张云; 张振中; 李海霞
学　校: 郑州大学
专　业: 药剂学
关键词: RNA干扰前列腺癌端粒酶逆转录酶 RT-PCR 凋亡碳纳米管
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

前列腺癌就是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤,是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果。前列腺癌的发病率具有明显的地理和种族差异。在欧美等发达国家和地区,它是男性最常见的恶性肿瘤,其死亡率居各种癌症的第二位；在亚洲,其发病率低于西方国家,但近年来呈迅速上升趋势。目前运用放疗、化疗、手术等方法来治疗前列腺癌,患者的生存率有明显提高,但是这些治疗方法选择性低,靶向性差。因此,随着分子生物学的飞速发展,基因靶向治疗前列腺癌的研究越来越受到关注。端粒酶是细胞中负责端粒的延长的一种基本的核蛋白逆转录酶,而人端粒逆转录酶(hTERT)是端粒酶重要的蛋白组分,其mRNA水平与端粒酶活性又密切关联,是调节端粒酶活性的限速步骤,特异性的抑制hTERT表达可以降低端粒酶的活性,从而抑制细胞的生长,直至死亡,所以hTERT可以作为基因治疗的理想靶点。在以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗研究中,一般都是采用RNA干扰(RNAinterference, RN Ai)技术来沉默hTERT基因,其中siRNA序列的设计合成是本研究的关键。本研究便是依据RNAi原理,以hTERT基因为靶点,选用hTERT高表达的前列腺癌PC-3细胞为研究对象,设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,通过体外转染前列腺癌PC-3细胞,筛选出有效序列,观察其对细胞增殖的抑制效果,hTERT mRNA与蛋白表达,以及细胞凋亡情况,并进一步探讨其机制。在本实验中首先选用的siRNA载体为脂质体载体LipofectaminTM2000,此外还选用了碳纳米管(Carbon Nanotube, CNT)作为siRNA的载体。但由于碳纳米管的水溶性较差,本实验中,采用单壁碳纳米管SWNT,通过对其表面修饰,即与DOTAP通过正负键结合,从而提高碳纳米管的水溶性,功能化后的碳纳米管可以很好的与siRNA结合,将siRNA迅速转入PC-3细胞中,以此来抑制细胞增殖。本研究通过以上方法为前列腺癌的治疗探索了一条新的途径。研究内容如下：一靶向hTERT siRNA有效序列的筛选对根据GenBank中人hTERT基因的mRNA序列(AF015950)和设计软件设计出的靶向hTERT siRNA在GenBank中进行BLASTTM分析,剔除非相关的基因同源序列,以此保证所设计序列的特异性；从hTERT cDNA区域中筛选,GC含量以50%以上最佳,设计选取出4条hTERT-siRNA,并合成出双链siRNA,以LipofectaminTM000介导转染前列腺癌PC-3细胞。分别采用SRB(磺酰罗丹明B)法,RT-PCR法评价其对细胞的生长,hTERT mRNA表达的抑制作用,从而筛选出效果最好的序列。二RNA干扰抑制hTERT表达诱导PC-3细胞凋亡利用筛选出的有效序列深入研究其机制,在此部分,用LipofectaminTM000将此siRNA序列转染入前列腺癌PC-3细胞后,以PI单染法,检测它们对细胞周期的影响；以Annexin V-FITC/PI双染法,检测它们对细胞凋亡的诱导作用；并以Western blot检测hTERT蛋白水平的变化,以此来探讨凋亡产生的机制。三新型碳纳米管SWNT-DOTAP的合成及其对PC-3细胞增殖的抑制作用在此部分中,首先创新性的合成了SWNT-DOTAP,考察其电位,粒径,与有效序列的结合率及对前列腺癌PC-3细胞的毒副作用,之后利用SWNT-DOTAP介导转染第一部分中筛选的有效序列到前列腺癌PC-3细胞中,从而研究其对前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用。结论：1：以hTERT基因为靶点,从所设计合成的4条siRNA序列从中成功筛选出了一条有效序列siRNA,即hTERT-siRNA-2。2：用LipofectaminTM2000将siRNA-2转染入PC-3细胞后,hTERT mRNA和蛋白的表达显著降低,其抑制率分别为85%和65%,证实了siRNA对PC-3细胞中hTERT基因的序列特异性。3：用LipofectaminTM2000将siRNA-2转染PC-3细胞后,同时发现siRNA-2能抑制细胞的生长,促进细胞凋亡,其作用的百分率分别为44%和14%,显示了一定的体外抗前列腺癌作用,为前列腺癌的基因治疗提供实验基础。4：成功制作成了DOTAP修饰的新型碳纳米管(SWNT-DOTAP)。初步研究发现SWNT-DOTAP对PC-3细胞的毒副作用很小,并且成功介导siRNA-2转染PC-3细胞,明显抑制PC-3细胞的增殖,抑制率达40%,与LipofectaminTM2000相当,这对以后运用碳纳米管在RNA干扰中作为载体奠定了实验基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-13
英文縮略词表  13-15
前言  15-25
  1 基因治疗  15-21
    1.1 基因治疗的主要分类  15-16
    1.2 基因治疗方法  16-19
    1.3 基因治疗载体  19-21
  2 RNAi技术  21-25
    2.1 RNAi简介  21
    2.2 作用机制  21-22
    2.3 特点  22-23
    2.4 RNAi中的中心因子siRNA  23-25
第一部分靶向hTERT siRNA有效序列的筛选  25-41
  1 材料与仪器  25-29
    1.1 细胞株  25
    1.2 试剂  25-26
    1.3 实验仪器设备  26-27
    1.4 主要试剂配制  27-28
    1.5 PCR引物  28
    1.6 siRNA的设计与合成  28-29
  2 实验方法  29-36
    2.1 细胞培养  29-31
    2.2 细胞转染  31-32
    2.3 SRB法检测siRNA对前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用  32
    2.4 逆转录PCR(RT-PCR)检测siRNA对前列腺癌PC-3细胞hTERT基因mRNA表达的抑制作用  32-36
    2.5 统计学分析  36
  3 结果  36-39
    3.1 siRNA对PC-3细胞生长的抑制作用  36-37
    3.2 总RNA的纯度和完整性分析  37-38
    3.3 siRNA抑制PC-3细胞hTERT mRNA的表达情况  38-39
  4 讨论  39-41
第二部分：RNA干扰抑制hTERT表达诱导PC-3细胞凋亡  41-53
  1 材料与仪器  41-44
    1.1 细胞株  41
    1.2 试剂  41-42
    1.3 实验仪器设备  42
    1.4 主要试剂配制  42-44
  2 实验方法  44-48
    2.1 细胞培养及转染  44
    2.2 PI单染检测siRNA转染后细胞周期相分布情况  44
    2.3 Annexin V-FITC/PI双染检测siRNA转染后的细胞凋亡情况  44-45
    2.4 蛋白印迹(Western-blot)检测siRNA对SMMC-7721细胞蛋白表达的抑制作用  45-48
    2.5 统计学分析  48
  3 实验结果  48-51
    3.1 流式细胞仪测定siRNA转染48h后对PC-3细胞周期的影响  48-49
    3.2 流式细胞仪测定siRNA转染48h后对PC-3细胞凋亡的影响  49-50
    3.3 Western-blot检测siRNA对PC-3细胞hTERT蛋白表达的影响  50-51
  4 讨论  51-53
第三部分 SWNT-DOTAP作为载体抑制PC-3细胞增殖  53-62
  1 材料与仪器  53-54
    1.1 细胞株  53
    1.2 试剂  53
    1.3 主要仪器  53-54
    1.4 主要试剂配制  54
  2 实验方法  54-57
    2.1 SWNT-DOTAP  54-55
    2.2 SRB法检测SWNT-DOTAP对前列腺癌PC-3细胞毒性的影响  55
    2.3 SWNT-DOTAP接载siRNA-2  55-56
    2.4 SRB法检测SWNT-DOTAP/siRNA-2对前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用  56-57
    2.5 统计学分析  57
  3 实验结果  57-60
    3.1 SWNT-DOTAP的物理参数  57-58
    3.2 SWNT-DOTAP对PC-3细胞毒性的影响  58-59
    3.3 SWNT-DOTAP对siRNA-2的接载率  59
    3.4 SWNT-DOTAP/siRNA对PC-3细胞生长的抑制作用  59-60
  4 讨论  60-62
全文总结  62-63
参考文献  63-66
致谢  66-67
个人简历和发表文章  67

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 男性生殖器肿瘤 > 前列腺肿瘤
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