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自噬早期激活可抑制醛固酮诱导的足细胞损伤

作　者: 王文琰
导　师: 张爱华; 黄松明
学　校: 南京医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 足细胞醛固酮自噬凋亡 ROS
分类号: R692
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肾小球滤过屏障是由肾小球脏层上皮细胞即足细胞，肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）和毛细血管内皮细胞构成的三层复合结构。各种原因导致的肾小球滤过屏障结构及功能的改变是蛋白尿产生的病理生理基础。近年来，诸多研究指出足细胞作为滤过屏障的重要组成部分，是一种终末分化细胞，几乎没有增殖能力，证据表明足细胞丢失20%可以引起系膜扩张、一过性轻度蛋白尿；足细胞丢失20%～40%除明显系膜扩张外，还会出现持续少量蛋白尿，球囊黏连和FSGS；足细胞丢失>40%,球囊黏连显著增加，肾小球硬化加剧，持续大量蛋白尿，进而引起肾脏功能进行性减退，最终可能发展为终末期肾衰竭（end-stage renal disease， ESRD）。醛固酮（aldosterone，Aldo）是肾素-血管紧张素系统的重要活性成份之一。通过经典的基因作用方式和非基因作用方式发挥生物学效应，诱导肾小球高压、激活糖皮质激素诱导蛋白激酶1（SGK1）以及氧化应激等引起足细胞凋亡和损伤，导致蛋白尿及肾小球硬化。最近许多研究更关注的是Aldo的非经典作用，可独立于肾素和血管紧张素系统，通过非血流动力学途径，改变细胞的生长行为和结构，在细胞水平上增加炎性反应、氧化应激、纤维化、系膜细胞增生及足细胞损伤，引起肾脏的损伤。自噬（Autophagy）是一个多步骤的降解过程，由膜包囊泡包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质进行降解，以维持细胞结构、功能和代谢的稳态。近年来随着自噬相关基因的发现及检测指标的确认，对自噬在细胞中的作用有了更深入的研究，外界因素对细胞产生的应激过程中，自噬可能对细胞起着重要的保护作用，但当长时间、大剂量持续应激，自噬则诱导细胞程序性死亡。在肾脏的缺血再灌注模型及顺铂、环孢霉素A等诱导肾小管上皮细胞的损伤过程中以及在阿霉素或嘌呤霉素模型等诱导足细胞的损伤过程中，自噬起着重要的保护作用。活性氧（reactive oxgen species，ROS）是生物体有氧代谢产生的一类活性含氧化合物的总称，包括超氧阴离子（O-2）、羟根离子（OH-）及非离子状态的过氧化氢（H2O2）等。细胞内的ROS大部分由线粒体电子氧化呼吸链（mitochondrial electron-transport chain，mETC）产生，除此之外NADPH氧化酶（NOX）、过氧化物酶体、脂加氧酶和细胞色素P450氧化酶也参与细胞内ROS的产生。ROS作为一种信号分子参与细胞增殖、分化及凋亡等重要生物学活性的调节，最近研究表明ROS，特别是线粒体源性ROS，作为信号分子参与自噬的调节。目的：本研究旨在探讨自噬在醛固酮诱导足细胞损伤中的作用，以及进一步阐明ROS对醛固酮诱导足细胞自噬的影响。方法：体外培养永生性小鼠足细胞系，应用Annexin V结合流式细胞术检测足细胞凋亡率，透射电子显微镜检测足细胞凋亡小体和自噬小体，荧光酶标仪检测足细胞活性氧生成，Western Blot检测自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）、凋亡相关蛋白caspase-3及足细胞分子nephrin的表达，实时定量PCR检测自噬相关基因Beclin-1的表达。结果：①醛固酮（10-7mol/L）呈时间依赖性诱导足细胞凋亡及下调nephrin表达，与对照组相比,,醛固酮刺激12h足细胞凋亡率差异无统计学意义，刺激24h凋亡率增加26.5%（P <0.05），nephrin表达下调28%（P＜0.05）；②醛固酮（10-7mol/L）呈时间依赖性诱导足细胞发生自噬，与对照组相比，醛固酮刺激6h自噬相关基因Beclin-1表达显著上调（P＜0.05），醛固酮刺激12h自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I比值增加（P＜0.05）；③应用3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬后，醛固酮诱导的足细凋亡提前发生，与对照组相比，刺激后12h足细胞凋亡率增加60%，3-MA处理组与醛固酮刺激24h相比，足细胞凋亡率增加39%（P＜0.05），nephrin表达下调19.5%（P＜0.05），并且caspase-3活化增加90%（P＜0.05）；④醛固酮呈时间依赖性诱导足细胞活性氧的生成，与对照组相比，醛固酮刺激2h、4h、8h、12h、24h其线粒体活性氧分别增加至1.3、1.3、1.6、1.7、1.9倍（P＜0.05），应用N-乙酰基半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）（750μmol/L）处理组后，再应用醛固酮刺激24h，NAC显著抑制醛固酮介导的自噬标志蛋白LC3-I（18KD）向LC3-II (16KD)转化（P＜0.05），并下调Beclin-1mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。结论：醛固酮可诱导足细胞发生自噬和凋亡，自噬的发生（12h）早于凋亡（24h），自噬早期激活抑制醛固酮诱导的足细胞凋亡，减轻足细胞损伤，并且ROS参与醛固酮诱导的足细胞自噬，以足细胞自噬为靶点可能成为治疗肾小球疾病的新研究方向。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-11
前言  11-24
  一、细胞自噬  11-17
  二、自噬与凋亡的相互关系  17-20
  三、活性氧与自噬  20-21
  四、自噬与足细胞疾病  21-22
  五、醛固酮与肾脏疾病  22-24
自噬早期激活抑制醛固酮诱导的足细胞损伤  24-53
  引言  26-27
  材料与方法  27-45
  结果  45-50
  讨论  50-53
全文小结  53-54
参考文献  54-58
综述  58-64
  参考文献  62-64
附录一英文缩略词  64-65
附录二就读期间科研工作小结  65-66
致谢  66-67

自噬早期激活可抑制醛固酮诱导的足细胞损伤

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