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心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的原核表达、纯化及其单克隆、多克隆抗体的制备与应用研究

作　者: 丛珊
导　师: 余晓东
学　校: 重庆师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人心脏型脂肪酸结合蛋白原核表达单克隆抗体多克隆抗体抗体配对人心脏型脂肪酸结合蛋白检测
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

通过RT-PCR扩增人心脏型脂肪酸结合蛋白H-FABP的基因片断，将目的基因与原核表达载体pET28a连接，构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，通过IPTG诱导表达人心脏型脂肪酸结合蛋白。利用pET28a构建的H-FABP原核表达质粒在BL21实现了高效表达，经SDS-PAGE电泳分析显示，表达的重组蛋白分子质量约为15kD。采用离子交换层析柱纯化H-FABP重组蛋白，通过Q-HP柱（pH11.5）纯化后得到高纯度H-FABP重组蛋白，含量约为0.48mg/mL。Western blotting鉴定纯化后重组蛋白特异性结果表明，所得重组蛋白与商品化的H-FABP单抗呈特异性反应。利用B细胞表位在线预测软件，综合分析蛋白结构β-转角，蛋白抗原表面可及性，蛋白柔韧性，蛋白抗原性，疏水性及线性抗原表位，我们选择了具有较强抗原特异性的H-FABP区段作为免疫原与重组H-FABP一起免疫动物。通过改良免疫方法将H-FABP全长抗原及表位肽免疫新西兰大白兔获得兔抗人H-FABP抗血清，应用蛋白A柱将抗血清中IgG组分纯化分离出来，应用亲和层析技术将抗体中针对重组蛋白标签的抗体去除，得到高特异针对H-FABP的兔抗人多克隆抗体。通过ELISA，Western blotting等方法证实了该抗体的高效价和高特异性。使用重组H-FABP全长抗原及表位肽免疫Balb/c小鼠，应用改良的杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与Balb/c小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0在聚乙二醇作用下融合，HAT选择性培养，间接酶联免疫吸附方法对融合细胞培养上清进行筛选，选择抗H-FABP单克隆抗体阳性的细胞株采用有限稀释法连续进行亚克隆，建立稳定分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠腹腔内诱生法扩大培养阳性单克隆细胞株后，腹腔注射石蜡处理过的小鼠，制备腹水。腹水经HiTrap IgG PurificationHP亲和层析柱纯化，所得的单克隆抗体进行效价测定，亲和力测定。经筛选得到6株稳定分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经亚类鉴定均为IgG型，6株单抗效价均在1：256000以上，亲和力最高可达9.02×10^-9。Western blotting鉴定表明6株单克隆抗体均具有较高的特异性。成功制备的这6株抗H-FABP特异性的单克隆抗体，可应用于建立一种新型H-FABP免疫检测方法。利用实验室已制备的抗H-FABP抗体作为捕获抗体和检测抗体，以H-FABP重组蛋白作为检测抗原,进行抗体配对试验，经过优化ELISA反应条件，分别检测26例临床AMI血清及34例正常血清标本中的H-FABP，并进行结果比较分析，结果成功得到了能检测天然H-FABP的配对抗体3-H5—1-F10，并以此成功建立了检测H-FABP的双抗体夹心ELISA方法。因此，所获得的高特异性抗体3-H5—1-F10将会为今后H-FABP的检测以及新型免疫检测试剂盒的研发奠定重要的基础。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
英文缩写一览表  9-14
1 引言  14-18
  1.1 研究目的和意义  14-15
  1.2 本研究的主要内容  15-17
    1.2.1 H-FABP 的高效原核表达与纯化  15
    1.2.2 抗 H-FABP 多克隆抗体的制备及鉴定  15-16
    1.2.3 抗 H-FABP 单克隆抗体的制备及鉴定  16
    1.2.4 抗 H-FABP 抗体在临床标本检测中的应用研究  16-17
  1.3 本研究的技术路线  17-18
2 H-FABP 的高效原核表达与纯化  18-38
  2.1 材料与方法  18-29
    2.1.1 主要材料与试剂  18
    2.1.2 主要仪器与设备  18-19
    2.1.3 主要试剂的配制  19-21
    2.1.4 方法  21-29
  2.2 结果  29-36
    2.2.1 确定拟克隆的基因序列和蛋白质序列  29-30
    2.2.2 逆转录 PCR（RT-PCR）扩增人 H-FABP  30-31
    2.2.3 重组质粒 pET28a-H-FABP 酶切鉴定  31-33
    2.2.4 pET28a-H-FABP 小量诱导表达  33-34
    2.2.5 大量诱导表达蛋白纯化  34-35
    2.2.6 纯化后 H-FABP 的浓度及特异免疫反应性鉴定  35-36
    2.2.7 纯化后 H-FABP 的 Western blotting 分析  36
  2.3 讨论  36-38
3 抗 H-FABP 多克隆抗体的制备及鉴定  38-47
  3.1 材料与方法  38-43
    3.1.1 实验动物与免疫原  38
    3.1.2 主要仪器与设备  38-39
    3.1.3 主要试剂的配制  39-41
    3.1.4 方法  41-43
  3.2 结果  43-45
    3.2.1 兔抗人 H-FABP 多克隆抗体效价测定  43-44
    3.2.2 Western Blotting 鉴定 H-FABP 多克隆抗体  44
    3.2.3 ELISA 鉴定 H-FABP 多克隆抗体特异性  44-45
  3.3 讨论  45-47
4 抗 H-FABP 单克隆抗体的制备及鉴定  47-58
  4.1 材料与方法  47-54
    4.1.1 实验动物、免疫原与细胞系  47
    4.1.2 主要仪器  47-48
    4.1.3 主要试剂  48-51
    4.1.4 方法  51-54
  4.2 结果  54-56
    4.2.1 抗 H-FABP 单克隆抗体的制备  54
    4.2.2 抗 H-FABP 单克隆抗体的纯化  54-55
    4.2.3 抗 H-FABP 单克隆抗体的鉴定  55-56
    4.2.4 Western blotting 鉴定抗 H-FABP 单克隆抗体特异性  56
  4.3 讨论  56-58
5 抗 H-FABP 抗体配对及其在临床标本检测中的应用研究  58-66
  5.1 材料与方法  58-61
    5.1.1 研究材料  58
    5.1.2 主要仪器与设备  58
    5.1.3 主要试剂  58
    5.1.4 方法  58-61
  5.2 结果  61-64
    5.2.1 HRP 标记抗体及效价测定  61
    5.2.2 抗体配对及条件优化  61-63
    5.2.3 双抗体夹心 ELISA 方法的建立及临床样本检测  63-64
  5.3 讨论  64-66
6 全文总结  66-67
7 文献综述  67-71
参考文献  71-79
作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况  79-80
致谢  80

心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的原核表达、纯化及其单克隆、多克隆抗体的制备与应用研究

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