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二氮嗪对H_2O_2损伤大鼠L6骨骼肌成肌细胞的作用及机制研究

作　者: 薛国钰
导　师: 邵素霞
学　校: 河北医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 二氮嗪 P-Akt Caspase-3 预处理 凋亡
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
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内容摘要


目的：在我国缺血性心脏病的发病率逐年提高，并已成为当今人类死亡的主要原因之一。目前干细胞移植入梗死区治疗缺血性心脏病已取得较大进展，但其治疗效果受多种因素的制约。影响其治疗效果的重要因素之一是移植入的干细胞的存活率低，研究表明，大量细胞在移植入受损心肌后约70-80%在3天内死亡。提高移植干细胞的存活率，可以从两方面入手，一是提高移植干细胞本身耐受恶劣环境的能力；二是改善移植的微环境。本实验室前期研究采用过氧化氢体外诱导L6骨骼肌成肌细胞（L6SKM）氧化应激损伤，观察应用二氮嗪预处理对过氧化氢氧化损伤L6SkM的作用，初步观察表明二氮嗪预处理对氧化应激损伤的成肌细胞具有保护作用，但具体机制不清。PI3K/Akt通路的活化对细胞存活非常重要。本实验体外建立成肌细胞氧化应激模型，继续研究二氮嗪对成肌细胞的作用，并探讨其保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系。方法：1不同浓度H2O2对L6SkM的作用体外培养L6骨骼肌成肌细胞（L6Skeletal Myoblast，L6SkM），用H2O2诱导L6SkM损伤。实验分正常对照组（normal control），H2O2损伤组（H2O2group）,浓度分别为0.20、0.40、0.60、0.80mmol/L，作用时间为（12小时、24小时）。通过MTT比色法检测各组细胞活力，摸索诱导H2O2氧化损伤的最佳浓度及时间，建立L6SkM H2O2氧化应激损伤模型。2不同浓度LY294002干预对经DZ预处理组L6SkM的作用体外培养L6骨骼肌成肌细胞（L6SkM），实验分正常对照组（normal control），H2O2损伤组（H2O2group,0.40mmol/L，24hours）；DZ预处理组（DZ group）：在培养基中先加入终浓度为200μmol/L的二氮嗪孵育30分钟，再换为含0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤；抑制剂组（LYgroup）：在培养基加入终浓度为200μmol/L二氮嗪的同时分别加入终浓度为25μmol/L（LY1）、50μmol/L（LY2）的LY294002共同孵育30min，再换为含0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤。通过MTT比色法检测各组细胞活力，观察不同浓度LY294002干预对DZ预处理后细胞活力的影响，摸索LY294002的适当浓度。3DZ预处理对H2O2损伤L6SkM的作用体外培养L6SkM。实验分正常对照组（normal control），H2O2损伤组（H2O2group,0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时），DZ预处理组（在培养基中先加入终浓度为200μmol/L的二氮嗪孵育30分钟，再换为含0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤），LY294002抑制剂组（在培养基加入终浓度为200μmol/L二氮嗪的同时加入终浓度50μmol/L的LY294002共同孵育30min，再换为含0.40mmo1/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤）。MTT比色法检测各组细胞活性; HE染色观察细胞的形态学变化；激光共聚焦显微镜观察各组细胞经JC-1染色的线粒体膜电位的变化。免疫细胞化学染色检测Caspase-3的表达；AnnexinV-FITC&PI检测各组细胞凋亡率;Western-blot法检测P-Akt、Caspase-3、Caspase-9的表达水平。结果：1不同浓度H2O2对L6SkM的作用MTT检测结果显示:随着H2O2浓度及时间的增加细胞活力逐渐下降，我们选择引起细胞活力下降50%左右的H2O2浓度0.40mmol/L作用24小时建立损伤模型。2不同浓度LY294002对L6SkM的作用MTT检测结果显示:与正常组比较，H2O2组的细胞活力明显下降；与H2O2组比较，DZ组的细胞活力明显上升；LY组细胞活力得到抑制，LY1组与H2O2组比较细胞活力有差异，LY2组与H2O2组比较细胞活力无差异，LY1组LY2组比较细胞活力无差异。3流式细胞仪检测细胞凋亡率:与正常组比较，H2O2组的细胞凋亡率明显升高至43.95±1.47%；与H2O2组比较，DZ组的细胞凋亡率明显降低至11.53±0.25%；LY组的细胞凋亡率升高至31.95±2.06%但低于H2O2组。4激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的荧光变化:正常细胞具有较高的膜电位，当细胞发生凋亡时，线粒体膜电位发生去极化。经JC-1染色后，正常细胞发出较强的红色荧光,绿光相对较弱，细胞凋亡时绿色荧光增强，红光减弱，用绿/红荧光强度比的变化说明线粒体膜电位的改变。结果显示与正常组比较，H2O2组绿/红荧光强度比增大，线粒体膜电位降低；DZ预处理，绿/红荧光强度比降低与正常组接近，能很好的维持细胞的膜电位；LY组绿/红荧光强度比升高与H2O2组接近，膜电位降低。5免疫组织化学染色法检测Caspase-3显示: H2O2组caspase-3蛋白表达明显高于正常对照组；DZ组caspase-3蛋白表达明显低于H2O2组，两组存在差异；LY组caspase-3蛋白的表达与DZ组相比上升，但还是低于H2O2组，两组存在差异。6Western-blot法检测结果6.1P-Akt蛋白的表达显示:与正常组比较，H2O2组的P-Akt蛋白表达明显降低;与H2O2组比较，DZ组的P-Akt蛋白表达明显升高；LY组的P-Akt蛋白表达与DZ组相比明显降低,且与H2O2组无差异。6.2Caspase-3,9蛋白的表达显示:与正常组比较，H2O2组的Caspase-3,9蛋白表达明显增加;与H2O2组比较，DZ组的Caspase-3,9蛋白表达明显降低；而LY组的Caspase-3,9蛋白表达与DZ组相比增加但低于H2O2组。结论：1二氮嗪预处理能够改善细胞形态、增加细胞存活率、提高线粒体膜电位水平及抑制凋亡，对氧化应激损伤L6SkM具有保护作用。2二氮嗪预处理的保护作用是通过激活了PI3K/Akt信号通路，下调凋亡蛋白caspase-3,9的从而抑制细胞凋亡，促进细胞存活。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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