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冬凌草甲素对人卵巢癌细胞增殖抑制、诱导凋亡作用及其机制的研究

作　者: 李娜
导　师: 金平
学　校: 兰州大学
专　业: 妇产科学
关键词: 冬凌草甲素 卵巢肿瘤 增殖 细胞凋亡 错配修复基因 甲基化
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的观察中药冬凌草的有效提取成分冬凌草甲素对人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖抑制及诱导凋亡作用,并探讨其可能的抗肿瘤作用机制。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察冬凌草甲素单药及冬凌草甲素联合顺铂对SKOV3细胞的增值抑制情况；倒置显微镜和透射电镜观察SKOV3细胞形态学和超微结构的改变；流式细胞术PI单染检测冬凌草甲素对细胞周期的影响；流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染检测冬凌草甲素对细胞凋亡率的影响；甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR, MSP)检测冬凌草甲素作用于SKOV3细胞前后,错配修复基因hMLH1基因CpG岛甲基化状态的变化；实时荧光定量PCR(QRT-PCP)检测冬凌草甲素作用于SKOV3细胞前后,bcl-2、bax、 survivin、hMLH1基因mRNA表达情况的变化。结果①MTT结果显示冬凌草甲素对卵巢癌SKOV3细胞的增殖具有抑制作用,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),且呈时间剂量依赖性,24,48,72h的半数抑制浓度(IC50)分别为45.22,33.85,22.48μmol/L;与顺铂合用具有协同抑制作用。②倒置显微镜下可见细胞生长明显受抑制。③透射电镜结果显示,冬凌草甲素组出现空泡变性,染色质浓缩,核染色质边集。④细胞周期显示冬凌草甲素组细胞周期被阻滞于S期和G2／M期。⑤Annex inV-FITC/PI双染检测冬凌草甲素(10,20,30μmol/L)作用细胞48h后细胞的凋亡率分别为(9.13±0.91)%,(18.89±1.79)%,(36.11±3.01)%,明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。⑥MSP结果显示hMLH1基因启动子区CpG岛在SKOV3细胞部分甲基化,冬凌草甲素作用细胞后,hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带减弱不明显,非甲基化特异性条带明显增强；⑦QRT-PCR结果显示冬凌草甲素作用细胞后,bcl-2、survivin基因mRNA表达下调,bax、hMLH1基因nRNA表达上调,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论①冬凌草甲素对人卵巢癌SKOV3细胞具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用;②其抗肿瘤机制一方面可能是通过下调bcl-2、survivin,上调bax mRNA的表达；另一方面可能是通过逆转hMLH1基因CpG岛的甲基化来实现的。

全文目录


中文摘要  3-4
Abstract  4-8
前言  8-12
材料和方法  12-22
  1. 实验材料  12-15
    1.1 肿瘤细胞株  12
    1.2 药品与主要试剂  12
    1.3 主要实验仪器  12
    1.4 主要溶液配制  12-15
  2 实验方法  15-22
    2.1 细胞培养  15
    2.2 MTT比色法检测细胞增殖抑制率  15-16
    2.3 倒置显微镜观察细胞形态  16
    2.4 透射电镜观察细胞超微结构  16
    2.5 碘化丙啶(PI)单染法检测细胞周期  16
    2.6 AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡率  16
    2.7 MSP检测hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化状态的改变  16-19
    2.8 QRT-PCR检测bcl-2、bax、survivin、hMLH1 mRNA的表达  19-21
    2.9 统计学方法  21-22
结果  22-30
  1. 冬凌草甲素对细胞增殖的影响  22-23
    1.1 冬凌草甲素单药对细胞增殖的影响  22-23
    1.2 冬凌草甲素联合顺铂对细胞增值的影响  23
    1.3 显微镜下观察冬凌草甲素对细胞增值的影响  23
  2. 冬凌草甲素对SKOV3细胞周期的影响  23-24
  3. 冬凌草甲素对SKOV3细胞凋亡的影响  24
    3.1 电镜下观察细胞凋亡的形态学的改变  24
    3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率  24
  4. 冬凌草甲素对bcl-2、bax、survivin mRNA表达的影响  24-25
  5. 冬凌草甲素对hMLH1基因CpG岛的甲基化的影响  25-30
    5.1 MSP检测冬凌草甲素作用前后hMLH1启动子区甲基化状态  25
    5.2 QRT-PCR检测冬凌草甲素作用前后hMLH1 mRNA的变化  25-30
讨论  30-34
结论  34-35
参考文献  35-39
附录 中英文缩略词表  39-41
在学期间研究成果  41-42
致谢  42

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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