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青冈栎单宁分离纯化及其抗疲劳、抗肿瘤活性研究

作　者: 梁钧淞
导　师: 邓业成; 甘耀坤
学　校: 广西师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 青冈栎 单宁 分离纯化 抗疲劳 抗肿瘤
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


青冈栎(Cyclobalanopsis glauca (Thunb.) Oerst.)为壳斗科(Fagaceae)青冈属(Cyclobalanopsis Oerst.)植物。青冈栎中含有大量生物活性物质,包括单宁、多糖、生物碱、多酚、VB2、VB1、VC、脂类等。本文以青冈栎果实单宁为研究对象,系统地研究了其分离提取工艺及其抗疲劳、抗肿瘤活性。采用超声波辅助提取法对青冈栎果实中的单宁进行提取,确定了其最佳提取工艺,获得青冈栎单宁。对青冈栎单宁的分离纯化进行研究,优化大孔吸附树脂分离青冈栎单宁的工艺条件。采用体内和体外评价方法研究了青冈栎单宁的抗疲劳和抗肿瘤活性,并对其作用机理进行探讨。本研究的主要结果如下：(1)对青冈栎果实的多酚类物质进行了测定,其中总多酚、总黄酮和单宁的含量分别为2.433%、0.325%和1.821%。(2)采用超声波提取法对青冈栎果实中单宁的提取工艺进行研究,利用单因素试验和响应面法试验优化青冈栎单宁的提取工艺。结果表明：①超声波辅助提取法提取青冈栎果实单宁的各因子对单宁提取率的影响不是简单的线性关系,各因子对单宁提取率影响的强烈程度为：超声波功率>乙醇体积分数>提取温度>液料比；②超声波辅助提取法提取青冈栎果实单宁的最佳提取工艺条件为：提取温度为50℃,乙醇浓度为61%,液料比为31：1,超声波功率为313W。在此条件下,青冈栎果单宁的提取率为1.978%。(3)对青冈栎单宁的分离纯化条件进行研究,研究了六种不同大孔树脂对青冈栎单宁静态和动态吸附及解吸效果,并对SP-700型大孔吸附树脂分离纯化青冈栎果单宁工艺进行优化,结果表明：①SP-700型大孔吸附树脂为青冈栎果实单宁分离纯化的理想树脂,其静态吸附率为87.32%,解吸率为85.69%；②SP-700型大孔树脂分离纯化青冈栎果单宁的最佳工艺条件为：控制上样初始浓度为0.4mg/mL,采用上样流速为1.0mL/min进行吸附,然后用70%乙醇以1.0mL/min的洗脱流速洗脱。此条件下吸附分离的单宁纯度可由原来的7.71%提高到28.76%。(4)系统地研究了青冈栎果单宁的体内外抗疲劳能力。以还原型谷胱甘肽(GSH)为对照物,通过体外和体内抗氧化模型评价了青冈栎果单宁的抗氧化活性,并在抗氧化活性分析的基础上,采用小鼠力竭游泳试验评价青冈栎果单宁抗运动性疲劳的活性,结果表明：①青冈栎果单宁具有较强的体外抗氧化作用。青冈栎果实单宁DPPH清除能力IC50值为1.73mg/mL,优于GSH的3.34mg/mL；青冈栎果实单宁对Fe3+的还原力略低于GSH,当CGFT浓度为GSH浓度的2倍左右时,两者还原力相当；青冈栎果实单宁对Fe2+具有较强的螯合力,且其螯合力随浓度的增加而增强,浓度增加至5mg/mL时螯合力可达79.82±2.03%；青冈栎果实单宁表现出较GSH强的清除O2-·能力,其清除O2-·能力的IC50值为1.03mg/mL,远优于GSH的3.67mg/mL；青冈栎果实单宁能够一定程度上抑制H2O2诱导的红细胞氧化性溶血,其抑制H2O2诱导红细胞氧化性溶血的IC50值为18.76mg/mL。②青冈栎果单宁具有较强的体内抗氧化活性,能提高小鼠体内抗氧化酶系的活力,使小鼠体内的抗氧化酶系SOD、 CAT和GSH-Px的活力分别提高了7.4%-15.3%、27.7%-56.1和26.9%-43.2%。③青冈栎果实单宁使鼠力竭游泳时间提高了30%-45%,使小鼠血糖和肝糖原的含量分别提高了23%-34%和1.9-3.4倍；青冈栎果实单宁能提高小鼠体内LDH活性,能加快清除或延缓小鼠体内乳酸和尿素氮的积累。(5)研究青冈栎果实单宁的体内外抗肿瘤作用。选用宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2和肺癌细胞H460为研究对象。采用MTT比色法测定了不同浓度的青冈栎单宁对三种肿瘤细胞增殖的抑制作用。以昆明小鼠为实验动物,通过动物建模的方法,研究青冈栎单宁的体内抗肿瘤效果,结果表明：①青冈栎果实单宁对宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2和肺癌细胞H460抑制作用的IC50值分别为2.402mg/mL、12.365mg/mL和14.240mg/mL;②青冈栎果实单宁能显著抑制实体瘤S180的生长,且具有剂量依赖关系,剂量为100mg/kg、50mg/kg、10mg/kg的抑瘤率分别为为57.49%、41.79%和28.17%。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
1 前言  12-21
  1.1 青冈栎生物学特性及其资源概况  12
  1.2 植物单宁的研究进展  12-17
    1.2.1 植物单宁的概念  13
    1.2.2 植物单宁的分离提取  13-15
    1.2.3 植物单宁的测定  15
    1.2.4 单宁的生物活性  15-16
    1.2.5 青冈栎单宁的开发前景  16-17
  1.3 疲劳与抗疲劳  17-18
    1.3.1 疲劳的定义及其产生机制  17
    1.3.2 抗疲劳与自由基  17-18
    1.3.3 单宁与抗疲劳作用  18
    1.3.5 抗疲劳作用的功能学评价方法  18
  1.4 肿瘤与抗肿瘤  18-19
    1.4.1 肿瘤的发生与治疗  18
    1.4.2 单宁的抗肿瘤作用机理  18-19
  1.5 研究目的和意义  19
  1.6 研究的主要内容及技术路线  19-21
2 青冈栎果实多酚类物质的测定  21-25
  2.1 实验材料与仪器  21
    2.1.1 实验材料  21
    2.1.2 实验试剂  21
    2.1.3 仪器设备  21
  2.2 实验方法  21-22
    2.2.1 青冈栎果实总酚含量的测定  21-22
    2.2.2 青冈栎果实总黄酮含量的测定  22
    2.2.3 青冈栎果实单宁含量的测定  22
  2.3 实验结果与分析  22-24
    2.3.1 多酚的标准曲线  22-23
    2.3.2 黄酮的标准曲线  23
    2.3.3 单宁的标准曲线  23-24
    2.3.4 青冈栎果实中多酚类物质的含量  24
  2.4 讨论与小结  24-25
    2.4.1 讨论  24
    2.4.2 小结  24-25
3 超声波辅助提取法提取青冈栎果实单宁的工艺研究  25-36
  3.1 实验材料与设备  25
    3.1.1 实验材料  25
    3.1.2 实验试剂  25
    3.1.3 仪器设备  25
  3.2 实验方法  25-26
    3.2.1 单宁含量的测定  25
    3.2.2 超声波辅助提取法提取青冈栎果实单宁工艺流程  25-26
    3.2.3 超声波辅助提取法提取青冈栎果实单宁单因素试验  26
    3.2.4 响应曲面法优化试验  26
  3.3 实验结果与分析  26-35
    3.3.1 青冈栎单宁提取单因素试验  27-29
    3.3.2 响应面分析法试验设计方案及回归模型的建立  29-35
  3.4 讨论与小结  35-36
    3.4.1 讨论  35
    3.4.2 小结  35-36
4 大孔树脂吸附分离青冈栎果实单宁的研究  36-42
  4.1 实验材料与仪器  36
    4.1.1 实验材料  36
    4.1.2 实验试剂  36
    4.1.3 仪器设备  36
  4.2 实验方法  36-38
    4.2.1 青冈栎果单宁样品溶液的制备  36
    4.2.2 大孔吸附树脂的预处理及筛选  36-37
    4.2.3 SP-700树脂对青冈栎果单宁动态吸附试验  37
    4.2.4 SP-700树脂对青闪栎果单宁富集能力研究  37-38
  4.3 实验结果与分析  38-41
    4.3.1 大孔吸附树脂的筛选  38
    4.3.2 SP-700树脂对青冈栎果单宁吸附-解吸工艺条件的优化  38-41
  4.4 讨论与小结  41-42
    4.4.1 讨论  41
    4.4.2 小结  41-42
5 青冈栎果实单宁的抗疲劳活性研究  42-53
  5.1 实验材料与设备  42-43
    5.1.1 实验材料  42
    5.1.2 实验试剂  42
    5.1.3 仪器设备  42-43
  5.2 实验方法  43-44
    5.2.1 青冈栎果实单宁体外抗氧化活性评价  43
    5.2.2 青冈栎果实单宁抗疲劳活性评价  43-44
    5.2.3 青冈栎果实单宁体内抗氧化活性评价  44
  5.3 实验结果与分析  44-52
    5.3.1 青冈栎果单宁体外抗氧化模型评价  44-48
    5.3.2 青冈栎果单宁体内抗氧化活性评价  48
    5.3.3 动物试验评价青冈栎果实单宁(CGFT)的抗疲劳功效  48-52
  5.4 讨论与小结  52-53
    5.4.1 讨论  52
    5.4.2 小结  52-53
6 青冈栎果实单宁的抗肿瘤活性初步研究  53-57
  6.1 实验材料与设备  53
    6.1.1 实验材料  53
    6.1.2 实验试剂  53
    6.1.3 仪器设备  53
  6.2 实验方法  53-55
    6.2.1 青冈栎果单宁(CGFT)体外抑制肿瘤细胞增殖实验  53-54
    6.2.2 青冈栎果单宁(CGFT)体内抑制肿瘤细胞增殖实验  54-55
  6.3 实验结果与分析  55-56
    6.3.1 体外抑制肿瘤细胞增殖作用  55
    6.3.2 体内抑制肿瘤细胞生长作用  55-56
  6.4 讨论与小结  56-57
    6.4.1 讨论  56
    6.4.2 小结  56-57
7 结论及展望  57-59
  7.1 结论  57-58
  7.2 本论文的主要创新点  58
  7.3 展望  58-59
参考文献  59-67
攻读硕士学位期间的学术成果  67-68
致谢  68-69

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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