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白斑综合征病毒（WSSV）三种重要囊膜蛋白的重组表达及在病害防控中的作用

作　者: 孙玉苗
导　师: 相建海
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 白斑综合征病毒（WSSV） VP28 活菌载体脊尾白虾 VP281
分类号: S945.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

由白斑综合征病毒（WSSV）引起的白斑综合症自从20世纪90年代初在东亚爆发以来，迅速蔓延至全球，造成了巨大的经济损失，成为危害虾产业最严重的传染性病毒病。迄今没有有效的策略防控该病毒。病毒囊膜蛋白在与宿主细胞受体相互作用，启动病毒感染的发生或介导病毒的侵入方面起着重要作用。WSSV囊膜蛋白导入虾体内，能够起到保护宿主抵抗WSSV的效果。这一防控WSSV的策略成为近年研究的热点。本研究对使用活的大肠杆菌（Escherichia coli）作为病毒囊膜蛋白递送入虾体内的载体的WSSV防控策略做了探索；同时对两个WSSV囊膜蛋白VP281和VP31的功能做了初步观察判断。研究主要包括以下内容和结果。1．本研究选择WSSV囊膜蛋白VP28，选用一种组成分泌型表达质粒pBTA1作为表达工具，使用活的大肠杆菌菌株DH5α作为递送载体，构建了表达VP28全长和膜外区的重组大肠杆菌，分别命名为DhpV和DhpVB。对两种重组菌的表达情况进行分析，结果显示二者皆能够组成型地表达目的蛋白，并顺利地把目的蛋白递送至胞外培养基中。2．为了检验其保护潜力，向脊尾白虾（Exopalamon carincauda Holthuis）中注射表达VP28的重组活菌DhpVB三次，在后两次导入重组活菌DhpVB的同时进行攻毒；使用含有空载体pBTA1的大肠杆菌作为对照。首次攻毒后，DhpVB和不带VP28的大肠杆菌在保护效果方面没有显著差别。第二次攻毒后，重组菌DhpVB显示出明显强于不带VP28的大肠杆菌的保护效果；重组菌DhpVB的抗性指数（Resistance index，RI）平均为0.67±0.08，不带VP28的大肠杆菌的RI为0.41±0.09；差异显著（P﹤0.05）。3．使用pET-30a(+)为表达载体，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3) pLysS为表达菌株，以包涵体的形式表达了WSSV囊膜蛋白VP28、VP281和VP31并使用螯合Ni2+的琼脂糖凝胶柱对包涵体蛋白进行了纯化。使用梯度透析去除尿素的方法对目的蛋白进行复性。这为以后探索VP281和VP31是否也同VP28一样具有保护宿主抵抗WSSV作用打下基础。4．尝试利用组成分泌型原核表达质粒pBTA1为表达载体，构建表达囊膜蛋白VP28、VP281或VP31的重组大肠杆菌菌株DH5α。组成型分泌rVP28和rVP281的重组菌构建成功，但含rVP281的重组菌与含rVP28的重组菌相比生长十分缓慢，推测rVP281的表达可能抑制大肠杆菌的生长。而组成型分泌rVP31的重组菌的构建未获成功。为弄清组成型分泌rVP31的重组菌未能成功构建的原因，使用pET-30a(+)为表达载体，构建了表达rVP31包涵体的重组菌株BL21(DE3) pLysS。将rVP31蛋白纯化并复性后，采用牛津杯法，检测rVP31蛋白的抗菌活性。以溶壁微球菌为受试菌，出现抑菌圈，表明rVP31对其具有抗菌作用。使用活的大肠杆菌有利于囊膜蛋白在虾体内的驻留；使用分泌型表达载体利于囊膜蛋白和虾的直接接触和相互作用。而且遗传背景清楚、大规模培养经济的大肠杆菌还可作为免疫增强剂增强保护效果。表达VP28的重组活菌在同虾发生足够的相互作用的条件下，能够提高虾抵抗WSSV的能力。本研究为防控WSSV提供了一个新的参考。另外，本研究首次观察到重组的WSSV囊膜蛋白VP281和VP31具有抗菌作用，增加了WSSV病毒学方面的知识。

全文目录

致谢  4-6
摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章文献综述  14-43
  1.1 前言  14-15
  1.2 脊尾白虾  15-17
  1.3 甲壳动物的免疫系统  17-21
    1.3.1 甲壳动物的先天免疫  18-21
    1.3.2 甲壳动物中类似特异免疫防御的现象  21
  1.4 白斑综合征病毒（white spot syndrome virus, WSSV）  21-40
    1.4.1 WSSV的命名  21-22
    1.4.2 虾类白斑综合症的症状  22
    1.4.3 WSSV的分类地位  22-23
    1.4.4 WSSV的大小、形态和结构  23-26
    1.4.5 WSSV的宿主范围和传播途径  26-29
    1.4.6 WSSV的DNA和蛋白研究  29-34
    1.4.7 WSSV的感染机制研究  34-37
    1.4.8 WSSV的防治研究  37-40
  1.5 本研究的目的和意义  40-43
第二章组成型分泌WSSV囊膜蛋白VP28 的重组活菌的构建  43-60
  2.1 材料和方法  43-52
    2.1.1 材料  43-47
      2.1.1.1 实验所选囊膜蛋白和报告基因  43-44
      2.1.1.2 实验所用的菌株和载体  44
      2.1.1.3 实验所用的引物  44-45
      2.1.1.4 实验所用培养基和溶液配制  45-47
    2.1.2 方法  47-52
      2.1.2.1 目的序列的克隆  47-49
      2.1.2.2 目的片段与表达载体的连接及宿主菌的转化  49-51
      2.1.2.3 重组菌DhpV和DhpVB的表达分析  51-52
  2.2 结果  52-58
    2.2.1 目的序列的克隆  52-53
    2.2.2 目的片段与表达载体的连接及宿主菌的转化  53-56
    2.2.3 重组菌DhpV、 DhpVB和DhpVP28-EGFP的表达分析  56-58
  2.3 讨论  58-60
第三章组成型分泌VP28 的重组活菌对脊尾白虾的保护试验  60-73
  3.1 材料和方法  60-65
    3.1.1 溶液配制及实验所用引物  60-61
    3.1.2 实验动物  61
    3.1.3 WSSV的制备和定量  61-62
    3.1.4 重组活菌DhpVB在脊尾白虾体内的驻留情况检测  62-63
    3.1.5 重组活菌DhpVB在脊尾白虾体内的表达分析  63-64
    3.1.6 攻毒实验  64-65
    3.1.7 数据统计  65
  3.2 结果  65-70
    3.2.1 WSSV的制备和定量  65-66
    3.2.2 重组活菌DhpVB在脊尾白虾体内的驻留情况检测  66-67
    3.2.3 重组活菌DhpVB在脊尾白虾体内的表达分析  67-68
    3.2.4 攻毒实验  68-70
  3.3 讨论  70-73
第四章 WSSV囊膜蛋白VP281、VP31 和VP28 的原核表达  73-86
  4.1 材料和方法  73-79
    4.1.1 材料  73-76
      4.1.1.1 候选WSSV囊膜蛋白  73
      4.1.1.2 实验使用的菌株和载体  73-74
      4.1.1.3 实验所用的引物  74
      4.1.1.4 实验所用的溶液配制  74-76
    4.1.2 方法  76-79
      4.1.2.1 目的序列的克隆  76
      4.1.2.2 目的片段与表达载体的连接及宿主菌的转化  76-77
      4.1.2.3 重组蛋白的表达分析  77-78
      4.1.2.4 重组蛋白的纯化、复性和浓度测定  78-79
  4.2 结果  79-84
    4.2.1 目的序列的克隆  79-80
    4.2.2 目的片段与表达载体的连接及宿主菌的转化  80-82
    4.2.3 重组菌的表达分析  82-83
    4.2.4 重组蛋白的纯化、复性和浓度测定  83-84
  4.3 讨论  84-86
第五章重组WSSV囊膜蛋白VP281 和VP31 的抗菌功能初步分析  86-96
  5.1 材料和方法  86-89
    5.1.1 材料  86-87
    5.1.2 方法  87-89
      5.1.2.1 含有组成分泌型表达载体pBTA1 的重组DH5α的构建  87
      5.1.2.2 重组菌DhpVP281 的表达检测  87
      5.1.2.3 rVP31 蛋白的获得  87
      5.1.2.4 重组菌DhpVP281、DhpVP28 和DhpVP28-EGFP的生长比较  87-88
      5.1.2.5 复性的rVP31 的抗菌作用检测  88-89
  5.2 结果  89-93
    5.2.1 重组菌DhpVP281 的构建  89-90
    5.2.2 重组菌DhpVP281 的表达分析  90-91
    5.2.4 WSSV囊膜蛋白VP281 对宿主菌大肠杆菌的抑制作用  91-93
    5.2.5 WSSV囊膜蛋白VP31 对溶壁微球菌的溶菌作用  93
  5.3 讨论  93-96
结论  96-97
参考文献  97-112
作者简历  112-113
攻读博士期间发表论文情况  113

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