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对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白基因vp26和vp28的克隆及在毕赤酵母中的表达

作　者: 汪琳
导　师: 马英
学　校: 集美大学
专　业: 水产养殖
关键词: 白斑综合症病毒 vp26基因 vp28基因 毕赤酵母 分泌表达
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 57次
引　用: 1次
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内容摘要


对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是全球对虾的主要病原之一,对全球对虾养殖业造成了严重的损失。目前在分子水平WSSV的感染和致病机理还未阐明,结构和功能基因的分析以及致病机理研究是目前WSSV研究的热点。WSSV是一种具有囊膜的双链DNA病毒,VP26和VP28是它的两个主要的囊膜蛋白,其中VP28已被初步证明在病毒吸附与入侵中起着关键作用,VP26研究较少,但它和VP28是同源蛋白。本研究成功实现了vp26和vp28基因在毕赤酵母中的分泌表达,为以后制备特异性抗体,开展WSSV的快速有效检测和WSSV亚单位疫苗的研制奠定了基础,同时为探索外源基因的真核表达积累了经验。1.vp26、vp28基因的克隆:根据GenBank库中对虾白斑病毒的全基因组序列,分别设计扩增该病毒主要结构蛋白基因vp26、vp28的相应引物,以从发病的斑节对虾(Penaeus monodon)中提取的总DNA为模板,利用PCR技术对目的基因进行了扩增,获得长度均为615bp的2个基因片段,片段大小与预期一致。将目的片段与pGEM-T-easy载体连接,导入大肠杆菌DH5α,获得阳性重组子pT-vp26、pT-vp28。目的片段测序结果与GenBank库中公布的vp26、vp28基因序列同源性达到了99%以上,说明已成功获得vp26和vp28基因片段,且基因在进化上非常保守。2.重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及表达产物的免疫活性:将vp26、vp28克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K-VP26、pPIC9K-VP28,经BglⅡ线性化酶切,电穿孔将其整合到毕赤酵母宿主菌GS115。重组毕赤酵母经PCR鉴定和G418筛选后进行甲醇诱导表达。表达产物分别进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA分析,结果表明:所得到的vp26和vp28基因都能够进行分泌表达,表达产物大小均为31kDa左右;Western blot和ELISA结果表明鼠抗血清可与获得的重组蛋白发生特异性反应。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章 前言  8-20
  1.1 对虾白斑综合症病毒(WSSV)的概述  8-14
    1.1.1 对虾白斑病的流行及症状  8
    1.1.2 对虾白斑病的宿主  8-9
    1.1.3 WSSV 的分类地位  9
    1.1.4 WSSV 的基因组研究  9-11
    1.1.5 WSSV 的结构蛋白  11-12
    1.1.6 WSSV 感染的分子机制  12
    1.1.7 WSSV 的诊断方法  12-14
    1.1.8 对虾白斑综合症病毒的防治进展  14
  1.2 毕赤酵母表达系统  14-19
    1.2.1 巴氏毕赤酵母表达外源蛋白的优势  15-16
    1.2.2 巴氏毕赤酵母表达宿主菌的种类  16
    1.2.3 巴氏毕赤酵母表达载体  16-17
    1.2.4 外源基因的转化方法  17
    1.2.5 外源基因整合的方式  17-19
  1.3 本研究的目的意义  19-20
第二章 材料与方法  20-34
  2.1 材料  20-23
    2.1.1 菌株和质粒  20
    2.1.2 动物材料  20
    2.1.3 酶与主要生化试剂  20
    2.1.4 主要溶液配制  20-22
    2.1.5 主要仪器  22-23
  2.2 方法  23-34
    2.2.1 技术路线  24-25
    2.2.2 vp26 和vp28 基因的扩增及扩增产物的纯化  25-26
    2.2.3 vp26 和vp28 基因克隆到T 载体及测序鉴定  26-28
    2.2.4 重组毕赤酵母表达载体的构建  28-30
    2.2.5 重组毕赤酵母的筛选及鉴定  30-31
    2.2.6 重组毕赤酵母的甲醇诱导表达  31-34
第三章 结果与分析  34-42
  3.1 PCR 扩增vp26 和vp28 基因  34
  3.2 vp26 和vp28 基因的鉴定及分析  34-36
  3.3 重组表达载体pPIC9K-VP26 和pPIC9K-VP28 的构建及鉴定  36-37
  3.4 外源基因的导入及重组毕赤酵母的筛选  37-38
  3.5 重组毕赤酵母小量表达产物的SDS-PAGE 分析  38
  3.6 重组毕赤酵母小量表达产物的Western blot 分析  38-39
  3.7 重组毕赤酵母小量表达产物的ELISA 分析  39
  3.8 重组毕赤酵母的大量表达  39-41
  3.9 表达蛋白的纯化及验证  41-42
第四章 讨论  42-46
  4.1 毕赤酵母高效表达的策略  42-44
  4.2 重组蛋白VP26 和VP28 的表达分析  44-46
第五章 结论与展望  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-54
附录  54-56
在学期间发表的学术论文  56

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治
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