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抗WSSV口服VP28亚单位疫苗研究及促克氏螯虾生长口服DNA药物研究

作　者: 张毅
导　师: 孟小林
学　校: 武汉大学
专　业: 生物医药工程
关键词: WSSV VP28 克氏螯虾 蛋白转导域TAT 口服 蛋白质亚单位疫苗 DNA疫苗 鼠伤寒沙门氏菌 鲤鱼生长激素 COS-7
分类号: S945.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是危害水产养殖业的高致病病原体。1992年白斑综合症病毒首次在中国台湾爆发，而后分别在日本、东南亚、北美等国家和地区爆发，造成虾大面积死亡，对水产养殖业造成了巨大的经济损失。各国研究学者不断探索防治WSSV感染的方法和措施，但是到目前为止还没有实际可行的防治方法问世。Tat蛋白是HIV-1的转录激活因子，研究发现该蛋白结构域中包含一个11个氨基酸序列的短肽，该短肽能够介导外源物质进入多种细胞或组织中，将其称为蛋白转导域TAT。蛋白转导域TAT作为转运载体已在哺乳动物细胞、昆虫细胞、小鼠中进行了广泛研究，但目前还未见其用于甲壳类动物——克氏螯虾。在本研究中构建重组质粒pET-28a-VP28; pET-28a-TAT-VP28;pET-28a-VP28-EGFP； pET-28a-TAT-VP28-EGFP，将上述质粒转化到基因工程表达菌株E.coli BL21(DE3)中，诱导表达目的蛋白。将纯化后的VP28-EGFP与TAT-VP28-EGFP融合蛋白喂食克氏螯虾，采用流式细胞术的方法证实，蛋白转导域TAT能够携带与其融合的外源蛋白穿过克氏鳌虾肠壁组织到达血淋巴中；通过荧光免疫组化方法证实TAT-VP28-EGFP融合蛋白存在于克氏螯虾中肠，肌肉和心脏等组织中。克氏螯虾分别免疫VP28，TAT-VP28蛋白质亚单位疫苗后，测定了血淋巴中酚氧化酶（PO）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力变化。实验结果表明克氏螯虾免疫TAT-VP28蛋白2小时后，血淋巴中的PO及SOD酶酶活均有显著提高；而克氏螯虾免疫VP28蛋白后的血淋巴中PO酶酶活没有变化，24小时后SOD酶酶活有一定提高。这一结果再次证实了TAT-VP28进入克氏螯虾血淋巴后，可以引发克氏螯虾体内的免疫反应。为了研究蛋白质亚单位疫苗的免疫效果，将VP28，TAT-VP28蛋白包被饲料后，以口服的方式、100μg/只的日剂量免疫克氏螯虾。分别连续免疫7天和14天后，进行病毒攻击实验。实验结果表明与阳性对照组在10天内达到90%以上的死亡率相比，TAT-VP28，VP28组其死亡率分别为43.3%、36.7%；60%、50.0%。为了研究蛋白质亚单位疫苗的免疫时效性。克氏螯虾连续免疫VP28，TAT-VP28蛋白14天，在免疫后的第3和7天分别进行病毒攻击进行病毒攻击实验。实验结果表明与阳性对照组在10天内达到90%以上的死亡率相比，TAT-VP28，VP28组其死亡率分别为43.3%、53.3%%；60%、66.7%。本研究首次报道和证实以克氏螯虾作为动物模型，VP28蛋白在蛋白转导域TAT介导下能够穿过虾肠壁组织到达血淋巴中。使亚单位疫苗能不通过肌肉注射的方式直接进入血淋巴中，通过血淋巴在虾体内的循环，使其到达到不同的组织中，同时也增强了虾血淋巴中酚氧化酶和超氧化物歧化酶酶活，从而增强克氏螯虾的免疫防御体系。该研究为预防和控制白斑综合症病毒提供了一种实际可行的新思路。鱼类生长激素(fish growth hormone, fGH)是由鱼类脑垂体合成并分泌的一种蛋白多肽。鱼类生长激素参与蛋白质合成和脂类代谢等生理功能，能够提高鱼类的生长速率，在水产养殖业中具有着重要的研究意义和应用价值。2008年研究学者将罗非鱼生长激素基因构建在真核表达载体中，通过胚胎电穿孔方法，将上述质粒转入到南方滨对虾胚胎受精卵中，与对照组比较幼虾的平均体重有32%的增加。减毒的鼠伤寒沙门氏菌作为DNA疫苗转运载体目前已经在鼠、雏鸡、鱼和克氏螯虾等体内得到广泛研究和应用，本研究首次将对虾抗菌肽Penaeidin-2信号肽与鲤鱼生长激素基因融合，将其构建到真核表达载体pcDNA3.1-中。用脂质体法将该质粒转染COS-7细胞，用RT-PCR和Western blot的方法证实SGH在人巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下在COS-7细胞中得到了高效表达。克氏螯虾幼虾分别注射50μg pcDNA3.1-和pcDNA3.1-SGH后的第3，7，14和21天，实时荧光定量PCR方法检测克氏螯虾血淋巴中Astacidin; Chymotryspin和Trypsin三种酶mRNA表达水平的变化。与对照组pcDNA3.1-比较，pcDNA3.1-SGH组血淋巴中Astacidin; Chymotryspin和Trypsin三种酶的转录水平显著上升。分别将50μg pcDNA3.1-, pcDNA3.1-SGH肌肉注射免疫克氏螯虾幼虾后，与对照组比较，在25天内克氏螯虾幼虾平均体重增加了22.2%以上。将重组质粒pcDNA3.1-SGH和质粒pcDNA3.1-通过电转的方法转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SV4089中，重组菌分别命名为SV/pcDNA3.1-SGH和SV/pcDNA3.1-。将重组菌SV/pcDNA3.1-SGH和重组菌SV/pcDNA3.1-包被饲料后，以109CFU/只日剂量连续喂食克氏螯虾幼虾十天。为了研究减毒鼠伤寒沙门氏菌SV4089能否有效携带DNA质粒到克氏螯虾幼虾体内，分别在免疫后的第1、3、7、10和14天，分别从克氏螯虾幼虾体内收集血淋巴、游泳足、腮、心脏、肝胰腺和尾肌等不同的组织，提取总RNA，结果在以上组织中检测到了gh的转录。将重组菌SV/pcDNA3.1-SGH和重组菌SV/pcDNA3.1-包被饲料后，以109CFU/只日剂量连续喂食克氏螯虾幼虾十天后，在免疫后的一个月内克氏螯虾幼虾体重增加了21%以上。本研究首次报道了生长激素口服DNA疫苗促进克氏螯虾幼虾生长，证实了减毒鼠伤寒沙门氏菌SV4089能够将质粒DNA运送到克氏螯虾幼虾体内。这项研究为促进甲壳类动物——克氏螯虾生长提供了一种新思路。

全文目录


第一部分 抗白斑综合症病毒口服 VP28 亚单位疫苗的研究  9-69
  本研究工作的创新点  9-10
  中文摘要  10-12
  Abstract  12-14
  引言  14-15
  第一章 文献综述  15-29
    1.1 白斑综合症病毒的研究进展  15-18
      1.1.1 WSSV 的形态结构和基因组  15-16
        1.1.1.1 WSSV 的形态结构  15-16
        1.1.1.2 WSSV 的基因组  16
      1.1.2 WSSV 结构蛋白  16-18
        1.1.2.1 VP28 蛋白  17
        1.1.2.2 VP19 蛋白  17
        1.1.2.3 VP26 蛋白  17-18
        1.1.2.4 VP15 蛋白  18
    1.2 WSSV 的感染宿主及传播途径  18-19
    1.3 WSSV 感染后虾体的症状和病理变化  19-20
    1.4 WSSV 的防治  20-24
      1.4.1 选育抗性基因和品种  20
      1.4.2 免疫增强剂  20-21
      1.4.3 抗体中和  21
      1.4.4 RNA 干扰  21-22
      1.4.5 疫苗  22-24
        1.4.5.1 灭活疫苗  22
        1.4.5.2 蛋白质亚单位疫苗  22-23
        1.4.5.3 DNA 疫苗  23-24
    1.5 WSSV 感染的诊断与检测  24-25
      1.5.1 PCR 检测  24
      1.5.2 免疫检测  24-25
      1.5.3 分子杂交检测  25
    1.6 TAT 蛋白转导域的研究进展  25-27
    1.7 本课题的研究意义  27-29
  第二章 实验材料与方法  29-43
    2.1 实验材料  29-33
      2.1.1 菌株、质粒以及目的基因  29
      2.1.2 主要试剂  29
      2.1.3 培养基的配制  29
      2.1.4 常用溶液的配制  29-30
      2.1.5 碱裂解法小量提取质粒所用溶液  30
      2.1.6 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  30
      2.1.7 丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液  30-31
      2.1.8 Ni 柱纯化所用溶液  31
      2.1.9 ProteinA 亲和层析相关溶液  31-32
      2.1.10 Western Blot 相关溶液  32
      2.1.11 鳌虾血淋巴抗凝剂  32-33
    2.2 试验方法  33-43
      2.2.1 vp28;tat-vp28;vp28-egfp;tat-vp28-egfp 基因的扩增  33-34
        2.2.1.1 vp28 基因的制备  33
        2.2.1.2 融合基因 tat-vp28 的制备  33
        2.2.1.3 egfp 基因的制备  33-34
      2.2.2 PCR 产物的回收、纯化与克隆  34-36
        2.2.2.1 PCR 产物的回收  34-35
        2.2.2.2 PCR 产物的克隆  35
        2.2.2.3 重组质粒转化大肠杆菌 JM 109  35-36
      2.2.3 大肠杆菌基因工程菌的制备和表达  36-37
        2.2.3.1 大肠杆菌基因工程菌的制备  36
        2.2.3.2 基因工程融合蛋白的表达  36-37
      2.2.4 融合蛋白的纯化  37-39
        2.2.4.1 融合蛋白的提取  37
        2.2.4.2 Ni-NTA Superflow 柱亲和层析法纯化融合蛋白  37-38
        2.2.4.3 超滤浓缩纯化后的融合蛋白并置换 Elution Buffer  38
        2.2.4.4 蛋白浓度的测定  38-39
      2.2.5 重组蛋白表达的 Western Blot 鉴定  39-40
        2.2.5.1 VP28 多克隆抗体的纯化  39
        2.2.5.2 Western Blot 操作方法  39-40
      2.2.6 荧光免疫组织化学检测  40
      2.2.7 冰冻切片 HE 染色  40-41
      2.2.8 流式细胞术  41
      2.2.9 克氏螯虾的口服蛋白质亚单位疫苗实验  41-42
        2.2.9.1 WSSV 的提取  41
        2.2.9.2 病毒滴度测定  41
        2.2.9.3 螯虾的口服疫苗与病毒攻击  41-42
      2.2.10 数据分析  42-43
  第三章 实验结果分析  43-58
    3.1 重组质粒的构建和表达  43-48
      3.1.1 重组质粒的构建  43-48
    3.2 TAT-VP28 蛋白的穿肠功能研究  48-52
      3.2.1 荧光免疫组织化学检测  48-49
      3.2.2 冰冻切片 HE 染色  49-50
      3.2.3 流式细胞术  50-52
    3.4 克氏螯虾体内 PO，SOD 酶活变化  52-54
      3.4.1 酚氧化酶（PO）活力分析  52-53
      3.4.2 超氧化物岐化酶(SOD)活力分析  53-54
    3.5 克氏螯虾口服蛋白质亚单位疫苗和病毒攻击实验  54-58
  第四章 讨论  58-61
  参考文献  61-69
第二部分 减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的生长激素口服 DNA 药物的研究  69-114
  本研究工作的创新点  69-70
  中文摘要  70-72
  Abstract  72-74
  第一章 文献综述  74-84
    1.1 鱼类生长激素的研究进展  74
    1.2 鱼类生长激素的分子结构  74-75
    1.3 鱼类生长激素的功能  75
    1.4 鱼生长激素促进鱼类生长的生理机制  75-76
    1.5 生长激素促进虾生长和发育的研究进展  76-79
      1.5.1 生长激素促进虾生长和发育  76-78
      1.5.2 添加饲料添加剂促进虾生长和发育  78-79
    1.6 DNA 疫苗的研究进展  79-81
      1.6.1 鼠伤寒沙门氏菌作为 DNA 疫苗的研究进展  80-81
    1.7 对虾抗菌肽信号肽的研究进展  81-84
  第二章 实验材料与方法  84-98
    2.1 实验材料  84-90
      2.1.1 菌株、质粒以及目的基因  84
      2.1.2 实验动物  84
      2.1.3 COS-7 细胞的培养  84
      2.1.4 主要试剂  84-85
      2.1.5 引物合成及测序  85
      2.1.6 培养基的配制  85-86
      2.1.7 常用溶液的配制  86
      2.1.8 碱裂解法小量提取质粒所用溶液  86
      2.1.9 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  86
      2.1.10 丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液  86-87
      2.1.11 Protein A 亲和层析相关溶液  87
      2.1.12 Western Blot 相关溶液  87-88
      2.1.13 Trizol 法提取法 RNA  88
      2.1.14 甲醛琼脂糖凝胶 RNA 电泳所用溶液  88-89
      2.1.15 cDNA 的逆转录  89-90
    2.2 试验方法  90-98
      2.2.1 sgh 基因的扩增  90-91
        2.2.1.1 融合基因 sgh 的制备  90-91
      2.2.2 PCR 产物的回收、纯化与克隆  91-93
        2.2.2.1 PCR 产物的回收  91
        2.2.2.2 PCR 产物的克隆  91-92
        2.2.2.3 重组质粒转化大肠杆菌 JM 109  92-93
      2.2.3 重组质粒 pcDNA3.1-SGH 转化减毒鼠伤寒沙门氏菌  93-94
        2.2.3.1 减毒鼠伤寒沙门氏菌感受态的制备  93
        2.2.3.2 质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌  93
        2.2.3.3 减毒鼠伤寒沙门氏菌阳性重组子的鉴定  93-94
      2.2.4 实时荧光定量 PCR 检测  94
      2.2.5 重组菌投喂克氏螯虾幼虾  94-95
      2.2.6 sgh 融合基因在虾体不同组织中转录水平的分析  95
      2.2.7 GH 多克隆抗体的制备和纯化  95-96
        2.2.7.1 多克隆抗体的制备  95
        2.2.7.2 多克隆抗体的纯化  95-96
      2.2.8 Western blot 检测 SGH 在 COS-7 细胞中的表达  96
      2.2.9 生长性能测定与分析  96-97
      2.2.10 减毒鼠伤寒沙门氏菌对螯虾的安全性试验  97
      2.2.11 数据分析  97-98
  第三章 实验结果  98-107
    3.1 重组质粒构建  98-99
    3.2 重组质粒 pcDNA3.1-SGH 在 COS-7 细胞中的体外表达  99-100
    3.3 实时荧光定量 PCR 检测  100-103
    3.4 重组菌 SV/pcDNA3.1-SGH 的鉴定  103
    3.5 DNA 疫苗在虾体内的表达  103-105
    3.6 口服 DNA 疫苗促进克氏螯虾生长  105-106
    3.7 减毒鼠伤寒沙门氏菌对螯虾的安全性试验  106-107
  第四章 讨论  107-109
  参考文献  109-114
附录  114-115
致谢  115

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治 > 虾类
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