学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜基因vp19、vp28的克隆、融合表达及中和抗体的制备

作　者: 李红霞
导　师: 孟小林
学　校: 武汉大学
专　业: 微生物学
关键词: WSSV vp19 vp28 融合蛋白中和抗体
分类号: S945.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 136次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是一种具有囊膜的双链DNA病毒,是造成自1993年以来中国、东南亚及美洲等世界范围内大面积暴发对虾病毒性疾病的主要病原。该病传播速度快,感染虾群在3～7d内死亡率高达90～100%,对我国及世界的对虾养殖造成了严重的危害,而目前尚未有有效的防治方法。WSSV的基因组大小为305,107bp,有5个主要的结构蛋白VP28、VPl9、VP26、VP24和VP15。目前在分子水平WSSV的感染和致病机理还未阐明,结构和功能基因的分析以及致病机理研究是目前WSSV研究的热点。现在还没有可用于WSSV增殖的细胞系,但已建立了成熟的动物模型。囊膜蛋白是病毒感染与致病力的重要决定因子,WSSV的囊膜蛋白与细胞受体的关系及其作用机理目前尚不清楚。WSSV有两个主要的囊膜蛋白VP19和VP28,其中VP28蛋白已被证明在病毒的吸附、侵入过程中起着重要的作用。病毒的入侵需要病毒与细胞表面受体的特异性结合,而囊膜蛋白的特异性抗体与病毒粒子的结合阻遏了病毒与细胞受体的结合,进而影响了病毒的吸附、侵入或脱衣壳过程,因此中和实验常被用来研究病毒粒子的结构蛋白或其功能域在病毒感染过程中的作用。现已有研究证明利用大肠杆菌表达的WSSV的囊膜蛋白VP28免疫兔子制备的抗血清在对虾体内具有一定中和病毒的能力。本研究采用大肠杆菌中表达的囊膜融合蛋白VP(19+28)作为抗原制备抗血清,以螯虾为动物模型,研究VP(19+28)的抗血清对WSSV的中和作用,这对于WSSV囊膜蛋白功能的研究、病毒的检测试剂及抗病毒药物的研发是一种有益的探索。本研究选取病毒的两种囊膜蛋白的融合体作为抗原,意在提高蛋白的抗原性,增强

全文目录

第一章对虾白斑综合症病毒  11-28
  1.1 对虾白斑综合症的病原体  11-13
    1.1.1 对虾白斑综合症病毒(WSSV)的命名  11-12
    1.1.2 对虾白斑综合症病毒(WSSV)的分类地位  12-13
  1.2 对虾白斑综合症的症状及病理变化  13
    1.2.1 对虾白斑综合症的症状  13
    1.2.2 对虾白斑综合症的病理变化  13
  1.3 WSSV在对虾体内的感染增殖及分布  13-15
    1.3.1 WSSV在对虾体内的感染增殖  13-14
    1.3.2 WSSV在感染患病对虾体内的分布  14-15
  1.4 WSSV的理化特性  15
  1.5 WSSV的大小、形态结构及其检测  15-17
    1.5.1 WSSV的大小、形态结构  15-16
    1.5.2 WSSV的检测  16-17
  1.6 WSSV的感染宿主、传播途径及暴发性流行的因素  17-18
    1.6.1 WSSV的感染宿主  17-18
    1.6.2 WSSV的传播途径  18
    1.6.3 WSSV造成对虾养殖重大损失的因素  18
  1.7 对虾组织培养及WSSV感染的动物模型  18-19
    1.7.1 对虾组织培养  18-19
    1.7.2 WSSV感染的动物模型  19
  1.8 WSSV的基因组及其编码的多肽  19-26
    1.8.1 WSSV的基因组及其稳定性  19-21
    1.8.2 WSSV基因组编码的多肽  21-26
      1.8.2.1 WSSV病毒粒子的主要结构蛋白  21-25
      1.8.2.2 编码结构蛋白的基因在基因组中的定位  25
      1.8.2.3 结构蛋白之间的同源性及其理化特点  25-26
  1.9 本研究的背景、目的和意义  26-28
第二章囊膜蛋白基因vp19、vp28的克隆、融合表达与纯化  28-43
  2.1 前言  28-29
  2.2 材料和方法  29-37
    2.2.1 材料  29
    2.2.2 重组表达载体pET-vp(19+28)的构建  29-35
      2.2.2.1 WSSV病毒基因组的制备  29
      2.2.2.2 PCR扩增vp19和vp28基因  29-30
      2.2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒的转化和提取  30-31
      2.2.2.4 vp(28+19)融合基因的克隆  31-32
      2.2.2.5 重组表达载体的构建  32-35
    2.2.3 外源蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达  35-37
      2.2.3.1 E.coli BL21(DE3)-pET-vp(19+28)的诱导表达  35
      2.2.3.2 表达产物的处理  35
      2.2.3.3 表达产物的SDS-PAGE鉴定  35
      2.2.3.4 Ni~(2+)柱亲和层析法纯化带His6标记的VP(19+28)蛋白  35-36
      2.2.3.5 组氨酸亲和层析柱的洗涤、再生和保存  36-37
  2.3 结果  37-41
    2.3.1 PCR扩增vp19和vp28基因  37
    2.3.2 vp(28+19)融合基因的克隆  37-39
    2.3.3 重组质粒pET-vp(19+28)的构建和鉴定  39
    2.3.4 外源蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达  39
    2.3.5 亲和层析法纯化带His6标记的VP(19+28)蛋白  39-41
  2.4 讨论  41-43
第三章囊膜蛋白VP(19+28)多克隆抗体的制备及其对病毒的中和作用  43-48
  3.1 引言  43
  3.2 材料与方法  43-45
    3.2.1 材料  43
    3.2.2 Bradford法测定蛋白质浓度  43-44
    3.2.3 VP(19+28)多克隆抗血清的制备  44
    3.2.4 多克隆抗体对病毒的中和作用  44-45
      3.2.4.1 病毒粗提液和健康螯虾粗提液的制备  44
      3.2.4.2 病毒粗提液的滴度  44-45
      3.2.4.3 多克隆抗体对病毒的中和作用  45
  3.3 结果  45-46
    3.3.1 病毒粗提液的滴度  45
    3.3.2 多克隆抗体对病毒的中和作用  45-46
  3.4 讨论  46-48
参考文献  48-56
附页  56-59
硕士期间发表和待发表的文章  59-60
致谢  60

对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜基因vp19、vp28的克隆、融合表达及中和抗体的制备

内容摘要

全文目录

相似论文