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噬菌体表面展示技术用于对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白的研究

作　者: 易志刚
导　师: 徐怀恕；黄倢；李筠
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: WSSV 虾细胞膜 多克隆抗体 VP28 VP281 ORF 噬菌体表面展示
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


对虾白斑综合症病毒(WSSV)是养殖对虾的一个主要病原，严重阻碍对虾养殖业的发展。WSSV基因组全序列的测定为其侵染机理的研究奠定了基础，其基因组学的研究重点正转向功能基因组学，即对其众多基因产物的解析。病毒的吸附蛋白作为病毒最先与宿主发生相互作用的蛋白，启动病毒的整个侵染过程，在病毒的生殖周期中发挥着相当重要的作用，也成为病毒防治的一个热点。WSSV的吸附蛋白(Virus attachment protein，VAP)的基因至今还未完全定位。WSSV已定位其基因的囊膜蛋白中的两种，VP28据报道在病毒入侵中发挥重要作用，可能是WSSV的一个吸附蛋白；另一定位的囊膜蛋白VP281序列分析中含有一细胞吸附序列(cell attachment sequence)，可能在病毒吸附中发挥作用。本研究对此2个蛋白进行噬菌体表面展示，确认其对宿主的吸附活性。另外通过对WSSV全序列的分析，找到数个可能的编码囊膜蛋白的开放阅读框(ORF)，分别对其进行展示，分析其对宿主细胞的结合活性。 用纯化的WSSV病毒粒子免疫新西兰大白兔，制备了WSSV的多克隆抗血清，用于病毒蛋白的定位。从对虾组织提取细胞膜粗膜制剂，包被96孔板，用地高辛标记的WSSV病毒与之结合，用酶标的抗地高辛抗体显色系统对其进行检测，确定其结合关系。以肝胰腺细胞膜、肌肉细胞膜、大肠杆菌包板作为阴性对照，结果显示病毒只与其敏感组织虾鳃细胞膜有明显特异性结合现象；未标记病毒与标记病毒竟争结合虾鳃细胞膜，证实了WSSV与虾鳃细胞膜间的特异性结合关系，显色反应的强弱指示结合活性的大小。绕过组织培养，建立了一个评价病毒粘附蛋白及虾受体蛋白结合活性的方法。虾细胞膜在变性条件下(SDS-PAGE)丧失病毒结合活性，提示此受体蛋白活性的结构依赖性。 对两个已经鉴定的WSSV囊膜蛋白VP28、VP281的基因进行了噬菌体表面展示。在WSSV全基因组中，针对VP28，VP281基因特定位点，用Primer Premier软件分别设计了一对引物，并引入Not Ⅰ，Sfi Ⅰ酶切位点，PCR扩增后，酶切、连接于噬菌体表面展示载体pCANTAB 5E，转导E. coli TG1，用辅助噬菌体M13K07进行超感染，得到展示VP28、VP281的重组噬菌体；重组噬菌体用Anti-E-tag抗体检测E-tag序列的表达与否；用WSSV的多克隆抗血清检测展示的VP28、VP281的抗原性。外源基因片段都得到了表达，VP28、VP281都保持较好的抗原性；展示的VP28、VP281与虾鳃细胞膜进行结合实验，结果VP28、VP281都没有结合活性，证明VP28、VP281可能不是WSSV的吸附蛋白。 分析WSSV全基因组序列，从中选取8个可能编码囊膜蛋白的开放阅读框(ORF)，设计PCR引物，对其进行噬菌体表面展示；用Anti-E-tag的抗体对展示ORF的重组噬菌体进行筛选，筛选出表达E-tag序列，即展示外源片段的重组噬菌体；展示ORF的重组噬菌体与包被于酶标板的虾鳃细胞膜进行结合实验，筛选出能与虾细胞膜结合的ORF的重组子；用能与虾鳃细胞膜结合的ORF展示产物与地高辛标记的WSSV竞争结合虾鳃细胞膜，看是否能竞争病毒与虾鳃细胞膜的结合。除ORFS#不能展示外，其余7个ORF都能获得展示;其中有4个ORF表现出与虾鳃细胞膜的结合活性，用此4个展示的ORF与WSSV竞争结合虾鳃细胞膜，其中只有ORFI#表现出竞争结合活性，提示此ORF可能编码WSSV的一个吸附蛋白。 用展示ORF的重组噬菌体感染五col了HBZ 1 51，从SOBAGN平板上挑取克隆，提取质粒鉴定插入片段，对阳性克隆进行增值，工PTG诱导表达。提取表达细胞的周质空间蛋白，进行免疫印迹实验(Westernblot)，用Anti一E一tag的抗体检测E一tag序列的表达情况;用WSSV的多克隆抗体对表达的蛋白进行定位。ORFI#能成功检测到E一tag序列的表达，即ORFI#蛋白的表达，得到2分子量分别为35.SKD、29.SKD的蛋白条带;用病毒多克隆抗体对其定位，未检测到阳性结果。其余ORF未检测到E一tag序列的表达。对表达成功的ORFI#的基因序列进行分析发现，在ATG下游有两个TATA box，且其后紧跟与第一个ATG同框的ATG起始密码子，其长度为8 1 3bp，编码蛋白的理论分子量为30.25KD。蛋白序列分析的结果发现其有烷基化、磷酸化、N糖基化等蛋白修饰位点。 本研究把噬菌体表面展示技术应用于WSSV囊膜蛋白的研究，证实已报道的wSSv的2囊膜蛋白vP28、vP281对宿主细胞没有结合活性;找到一个可能编码病毒吸附蛋白的ORF，对其蛋白序列分析，存在潜在的蛋白修饰位点。

全文目录


中文摘要  10-12
英文摘要  12-14
综述第一节: WSSV研究进展  14-26
  1 WSSV的危害及历史  15
  2 白斑病的症状  15-16
  3 患病对虾组织病理学变化  16
  4 WSSV的宿主范围、传播途径  16-17
  5 WSSV形态特征  17-18
  6 WSSV结构、功能及基因组学研究概况  18-21
    6.1 WSSV基因组  18-19
    6.2 WSSV结构蛋白研究  19-20
    6.3 WSSV非结构蛋白研究  20-21
    6.4 WSSV分类地位及地理株间的差异  21
  7 基因组学研究的一些方法  21-26
    7.1 从蛋白到基因途径  22
    7.2 从基因到蛋白途径  22
    7.3 蛋白相互作用的研究  22-26
综述第二节: 噬菌体表面展示应用于分子识别研究  26-40
  1 噬菌体展示载体的主要类型  28-29
    1.1 噬菌体载体  28-29
    1.2 噬菌体质粒载体  29
  2 噬菌体展示载体的构建  29-32
    2.1 随机肽库的构建  29-30
    2.2 cDNA展示文库的构  30-31
    2.3 片段展示库  31-32
    2.4 随机突变库  32
  3 噬菌体文库的筛选  32-34
  4 噬菌体表面展示具体应用举例  34-40
    4.1 噬菌体表面展示技术与抗体库相结合构建噬菌体抗体库  34
    4.2 蛋白功能域的定位  34
    4.3 酶或受体抑制剂的筛选  34
    4.4 基因表达调控方面的应用  34
    4.5 在基因治疗方面的应用  34-40
第一章 病毒多克隆抗体的制备及与虾细胞膜特异性结合关系的确立  40-61
  第一节 病毒的纯化及标记  41-48
    1 材料与方法  41-44
      1.1 病毒纯化  41-42
      1.2 病毒蛋白定量  42
      1.3 病毒的地高辛标记  42
      1.4 标记效果验证  42-43
      1.5 病毒蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分析  43-44
    2 结果  44-47
      2.1 病毒的纯化  44-45
      2.2 病毒蛋白的定量  45-46
      2.3 病毒的标记结果验证  46
      2.4 病毒的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  46-47
    3 讨论  47-48
  第二节 病毒多克隆抗体的制备  48-52
    1 材料方法  48-49
      1.1 免疫程序  48
      1.2 抗血清的获得  48
      1.3 抗血清效价的测定  48-49
      1.4 抗血清的吸收  49
      1.5 抗血清Westernblot分析  49
    2 结果  49-51
      2.1 抗血清效价的测定  50
      2.2 抗血清的Westernblot分析  50-51
    3 讨论  51-52
  第三节 虾细胞膜的提取及虾细胞膜与病毒特异性结合关系的确立  52-61
    1 材料与方法  52-54
      1.1 病毒纯化  52
      1.2 病毒蛋白定量  52
      1.3 病毒的地高辛标记及标记效果验证  52
      1.4 虾组织匀浆液蛋白酶活性的测定  52
      1.5 虾细胞膜的提取  52-53
      1.6 病毒与虾细胞膜的结合实验  53
      1.7 未标记病毒竞争结合标记病毒  53-54
      1.8 虾细胞膜变性条件下与病毒的结合  54
    2 结果  54-59
      2.1 实验用虾  54-55
      2.2 病毒纯化与标记  55
      2.3 虾细胞匀浆液蛋白酶活性的测定  55-56
      2.4 虾细胞膜蛋白浓度的测定  56
      2.5 虾细胞膜的提取  56-57
      2.6 标记病毒与虾细胞膜的结合实验  57
      2.7 未标记病毒与标记病毒竞争结合对虾鳃细胞膜  57-58
      2.8 虾鳃细胞膜变新条件下与病毒的结合  58-59
    3 讨论  59-61
第二章 VP28、VP281的噬菌体表面展示  61-87
  第一节 VP28，VP281引物设计及PCR扩增  62-71
    1 材料和方法  62-65
      1.1 引物的设计  62-63
      1.2 PCR扩增  63-65
      1.3 PCR产物回收  65
    2 结果  65-68
      2.1 引物设计  65-66
      2.2 PCR产物分析  66-68
      2.3 PCR产物回收后定量  68
    3 讨论  68-71
  第二节 VP28、VP281的噬菌体表面展示  71-80
    1 材料和方法  71-76
      1.1 PCR产物的限制性内切酶消化  71
      1.2 PCR酶切消化产物的纯化  71-72
      1.3 酶切产物的定量  72
      1.4 酶切产物与噬菌体展示载体的连接  72-73
      1.5 感受态细胞的制备  73
      1.6 电转导  73-74
      1.7 重组噬菌体克隆的增殖  74
      1.8 重组插入片段检测  74-76
      1.9 重组噬菌体表达E-tag的筛选  76
    2 结果  76-79
      2.1 酶切产物的定量  76-77
      2.2 连接子的转导  77
      2.3 重组子插入片断筛选  77-78
      2.4 重组噬菌体表达E-tag的筛选  78-79
    3 讨论  79-80
  第三节 VP28，VP281重组噬菌体与虾鳃细胞的结合试验  80-84
    1 材料与方法  80-81
      1.1 由插入片段及E-tag抗体检测为阳性的克隆进行扩大规模的增殖  80
      1.2 重组噬菌体pfu的测定  80-81
      1.3 阳性克隆表达E-tag的检测及WSSV多克隆抗体的检测  81
      1.4 重组噬菌体与虾细胞膜的结合试验  81
    2 结果  81-83
      2.1 阳性克隆的扩大增殖及E-tag、WSSV多抗检测  81-82
      2.2 VP28，VP281重组噬菌体与虾鳃细胞膜的结合试验  82-83
    3 讨论  83-84
  本章常用试剂一览表  84-87
第三章 WSSV几种可能编码囊膜蛋白的ORF的噬菌体表面展示  87-104
  第一节 用于噬菌体展示的ORF的筛选及引物设计  88-91
    1 材料与方法  88
      1.1 ORF的筛选  88
      1.2 各ORF引物的设计  88
    2 结果  88-90
      2.1 ORF的筛选  88-90
      2.2 各ORF的引物设计  90
    3 讨论  90-91
  第二节 各ORF的噬菌体表面展示  91-98
    1 材料与方法  91-94
      1.1 目的ORF的PCR扩增  91-92
      1.2 PCR产物的限制性酶消化、与载体的连接  92-94
      1.3 连接子的转导  94
      1.4 转导子的筛选  94
    2 结果  94-97
      2.1 目的ORF的PCR扩增  94-95
      2.2 PCR产物的限制性酶切消化、定量  95-96
      2.3 重组子质粒提取筛选  96
      2.4 重组噬菌体表达E-tag的筛选  96-97
    3 讨论  97-98
  第三节 展示的ORF与虾鳃细胞膜的结合实验  98-104
    1 材料与方法  98-99
      1.1 阴性克隆的大量增殖  98
      1.2 阳性克隆表达E-tag的检测  98
      1.3 重组噬菌体与虾鳃细胞膜的结合的筛选  98
      1.4 虾鳃细胞膜结合阳性克隆与虾鳃细胞膜的结合实验  98
      1.5 重组噬菌体与WSSV-DIG竞争结合虾鳃细胞膜  98-99
      1.6 WSSV竞争结合重组噬菌体与虾鳃细胞膜的结合  99
    2 结果  99-102
      2.1 阳性克隆增值后E-tag表达的检测  99-100
      2.2 重组噬菌体与虾鳃细胞膜的结合的筛选  100
      2.3 虾鳃细胞膜结合阳性克隆与虾鳃细胞膜的结合实验  100-101
      2.4 重组噬菌体与WSSV-DIG竞争结合虾鳃细胞膜  101-102
      2.5 WSSV竞争结合重组噬菌体与虾鳃细胞膜的结合  102
    3 讨论  102-104
第四章 ORF的非融合表达  104-121
  第一节 重组噬菌体感染非融合表达宿主HB2151  105-107
    1 材料与方法  105-106
      1.1 对数期HB2151的准备  105
      1.2 重组噬菌体感染HB2151  105
      1.3 重组子筛选  105
      1.4 克隆的大量增殖及诱导表达  105-106
    2 结果  106
    3 讨论  106-107
  第二节 非融合蛋白westerblot分析  107-113
    1 材料与方法  107-108
      1.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳  107
      1.2 SDS-PAGE后电转印  107-108
      1.3 免疫检测  108
    2 结果  108-112
      2.1 非融合表达蛋白的SDS-PAGE  108-109
      2.2 病毒多抗对表达蛋白的检测  109-111
      2.3 Anti-E-tag抗体对表达蛋白进行Westernblot分析  111-112
    3 讨论  112-113
  第三节 ORF1#序列分析  113-121
    1 材料与方法  113
      1.1 基因片段分析  113
      1.2 蛋白序列分析  113
    2 结果  113-118
      2.1 基因片段分析  113-114
      2.2 ORF1#蛋白序列分析  114-118
    3 讨论  118-121
致谢  121

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