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以枯草芽孢杆菌递呈对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28对凡纳对虾抗病毒免疫保护机制的研究

作　者: 丁晶
导　师: 傅玲琳; 蒋跃明
学　校: 浙江工商大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 对虾白斑综合征病毒(WSSV) 重组菌株B.subtilis-VP28 体液免疫因子 免疫基因 细胞吞噬 选择性剪接 免疫球蛋白超家族分子(Dscam) 变构体库
分类号: S945.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)传染性强、宿主范围广、致死率高,是我国及世界对虾养殖业发生爆发性流行病的主要病原,严重制约着对虾养殖业的健康发展。本课题组前期实验成功构建了表达WSSV囊膜蛋白-VP28的重组工程菌(B.subtilis-VP28),并研究发现了该菌株能显著提高攻毒后的中国对虾和螫虾存活率并且能特异性保护机体抗WSSV感染,但此免疫保护机制还不甚清楚。本课题在此基础上,通过口服重组菌株B. subtilis-VP28免疫凡纳对虾,研究B.subtilis-VP28对凡纳对虾抗WSSV感染的保护效果及免疫功能的影响,并克隆分析与对虾适应性免疫相关的免疫球蛋白超家族分子Dscamn可变区序列,从Dscam识别与细胞吞噬途径探讨重组菌B.subtilis-WP28诱导对虾特异性抗病毒感染的分子机制。主要研究内容和结果如下：1.重组菌株B.subtilis-WP28对凡纳对虾体液免疫因子的影响以芽孢重组菌B.subtilis-VP28作为免疫原口服免疫凡纳对虾,并以B.subtilis和正常健康对虾作为对照,进行攻毒实验,并取对虾血清检测抗菌活力、溶菌活力、酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性和碱性磷酸酶(AKP)活性,另外取对虾血细胞抽提总RNA,采用荧光定量PCR方法检测Toll样受体、溶菌酶、血蓝蛋白和Dscam基因的mRNA相对表达量。实验结果表明,B.subtilis-VP28能显著提高凡纳对虾血清各免疫因子的活性,说明B.subtilis-VP28对凡纳对虾机体的体液免疫功能具有显著的增强作用。此外,B.subtilis-VP28还能显著提高Toll样受体、溶菌酶、血蓝蛋白和Dscam基因的mRNA转录水平,揭示B.subtilis-VP28能够介导凡纳对虾机体启动免疫应答反应并释放免疫因子2.重组菌株B.subtilis-VP28对凡纳对虾血淋巴细胞特异性吞噬的影响将重组菌株B.subtilis-VP28的芽孢形式和海藻多糖口服投喂免疫凡纳对虾28d,并以B.sub til is和正常健康组作对照,分别在免疫4d、7d、14d、28d后,检测不同试验组凡纳对虾血细胞吞噬活性。另外分别在免疫4d、14d、28d后,差异分析各试验组血.细胞对不同抗原(WSSV和弧菌)的吞噬功能。实验结果表明,在免疫不同时间内,B.subtil is-VP28均能显著提高凡纳对虾血细胞吞噬WSSV功能,从而诱导机体产生细胞免疫。此外,在不同免疫时间内B.subti/is-VP28能显著提高血细胞对WSSV的吞噬(与其对弧菌的吞噬能力相比)；而B.sub til is组和海藻多糖组的对虾血细胞对吞噬WSSV和弧菌不存在显著性差异。说明B.subti/is-VP28具有诱导凡纳对虾血细胞特异性吞噬WSSV的作用,揭示B.subtilis-VP28可通过引发凡纳对虾血细胞特异性吞噬作用介导机体的特异性抗病毒感染。3.凡纳对虾Dscam选择性剪接外显子位点鉴别及可变区序列分析根据Genbank公布的凡纳对虾Dscam (LvDscam)的cDNA序列,分别以该基因的免疫球蛋白区和粘连蛋白区序列设计特异性引物,经过PCR扩增、克隆及测序后,由多重序列比对得知：LvDscam存在3个选择性剪接外显子,分别位于Ig2-N (126-177aa)、Ig3-N (228-268aa)和整个Ig7区(603-698aa)。正常情况下LvDscam可通过RNA选择性剪接机制产生3个Ig2-N区变构体、4个Ig3-N区变构体和2个Ig7区变构体,说明LvDscam具有分子多样性。另外,由系统发育树分析可知：LvDscam在系统发育树的无脊椎动物分枝上占据一个单独的进化亚单位分枝,预示着LvDscam可能是一种新型的无脊椎动物Dscam蛋白。4.差异分析不同免疫原刺激凡纳对虾Dscam特异性变构体库的特征口服重组菌株B.subtilis-VP28和海藻多糖免疫凡纳对虾28d,并以B. subtilis和正常健康组作对照,根据LvDscam可变区序列设计特异性引物,克隆LvDscam可变区片段,并随机选取15个克隆子送至测序。由多重序列比对得知：B.sub(ilis-VP28、B.subtilis、海藻多糖共引发LvDscam产生13个Ig2-N区变构体,15个Ig3-N区变构体和11个Ig7区变构体,预测可编码2145(13×15×11=2145)种LvDscam选择性剪接变构体,由此可说明LvDscam具有丰富的分子多样性。通过组间LvDscam变构体多重序列比对,LvDscam能形成免疫原特异性变构体库。其中,B.subtilis-VP28还能引发LvDscam分别产生一个新型Ig2-N变构体模式和一个新型Ig3-N变构体模式,推测B.sublilis-VP28特异性的LvDscam变构体库可介导B.subtilis-VP28引发机体的特异性抗WSSV感染。

全文目录


摘要  3-7
ABSTRACT  7-15
第1章 引言  15-26
  1.1 对虾白斑综合征病毒(WSSV)研究现状  15-21
    1.1.1 对虾白斑综合征病毒(WSSV)的基本特征  15-16
    1.1.2 对虾白斑综合征病毒(WSSV)的功能基因研究  16-20
    1.1.3 基于VP28蛋白的抗WSSV免疫防治研究  20-21
  1.2 无脊椎动物免疫系统的研究进展  21-25
    1.2.1 先天性免疫系统  21-22
    1.2.2 适应性免疫系统  22-25
  1.3 课题研究的目的和意义  25-26
第2章 重组菌株B.subtilis-VP28对凡纳对虾体液免疫因子的影响  26-41
  2.1 实验材料和仪器  26-28
    2.1.1 实验对虾  26-27
    2.1.2 实验菌株  27
    2.1.3 主要试剂  27
    2.1.4 主要仪器  27
    2.1.5 主要试剂的配制  27-28
  2.2 实验方法  28-35
    2.2.1 芽孢工程菌B.subtilis-VP28制备及纯化  28-29
    2.2.2 实验虾料制备  29
    2.2.3 口服免疫实验  29-30
    2.2.4 攻毒实验  30
    2.2.5 WSSV的PCR检测  30
    2.2.6 血清免疫指标的测定  30-31
    2.2.7 数据处理  31
    2.2.8 免疫基因的荧光定量  31-35
  2.3 结果与分析  35-38
    2.3.1 重组菌株B.subtilis-VP28的抗WSSV保护效果  35-36
    2.3.2 B.subtilis-VP28对凡纳对虾血清免疫因子的影响  36-37
    2.3.3 B.subtilis-VP28对凡纳对虾免疫基因的影响  37-38
  2.4 讨论  38-41
    2.4.1 B.subtilis-VP28对凡纳对虾抗WSSV感染的保护效果  38
    2.4.2 B.subtilis-VP28对凡纳对虾血清免疫因子的影响  38-39
    2.4.3 B.subtilis-VP28对凡纳对虾免疫基因表达的影响  39-41
第3章 重组菌株B.subtilis-VP28对凡纳对虾血淋巴细胞特异性吞噬的研究  41-51
  3.1 实验材料和仪器  41-43
    3.1.1 实验病毒和菌种  41-42
    3.1.2 实验对虾  42
    3.1.3 主要试剂  42
    3.1.4 实验仪器  42
    3.1.5 实验主要试剂配制  42-43
  3.2 实验方法  43-45
    3.2.1 实验虾料制备  43
    3.2.2 口服免疫实验  43
    3.2.3 对虾血细胞的分离  43-44
    3.2.4 抗原荧光标记  44
    3.2.5 细胞吞噬实验  44-45
    3.2.6 数据处理  45
  3.3 结果分析  45-49
    3.3.1 B.subtilis-VP28对血细胞吞噬WSSV的影响  45-46
    3.3.2 B.subtilis-VP28引发的血细胞特异性吞噬WSSV的分析  46-49
  3.4 讨论  49-51
    3.4.1 B.subtilis-VP28对凡纳对虾血细胞吞噬活性的影响  49
    3.4.2 B.subtilis-VP28引发凡纳对虾血细胞特异性吞噬WSSV的研究  49-51
第4章 凡纳对虾Dscam选择性剪接外显子位点及可变区序列分析  51-62
  4.1 实验材料和仪器  51-53
    4.1.1 实验对虾  51
    4.1.2 主要试剂  51-52
    4.1.3 主要仪器  52
    4.1.4 主要试剂配制  52-53
  4.2 实验方法  53-56
    4.2.1 对虾血细胞总RNA的抽提及检测  53
    4.2.2 cDNA的合成和检测  53
    4.2.3 目的片段的获取  53-54
    4.2.4 DNA 5’末端磷酸化  54-55
    4.2.5 目的片段的克隆  55-56
    4.2.6 阳性克隆子测序  56
    4.2.7 生物信息学分析  56
  4.3 结果与分析  56-60
    4.3.1 总RNA的提取  56-57
    4.3.2 基因组DNA污染检测  57
    4.3.3 目的片段PCR扩增  57-58
    4.3.4 菌液PCR验证  58-59
    4.3.5 LvDscam选择性外显子位点鉴别  59
    4.3.6 LvDscam可变区序列分析  59-60
    4.3.7 LvDscam系统进化分析  60
  4.4 讨论  60-62
第5章 差异分析不同免疫原刺激凡纳对虾Dscam特异性变构体库的特征  62-76
  5.1 实验材料和仪器  63-64
    5.1.1 实验对虾  63
    5.1.2 实验菌株  63
    5.1.3 主要试剂  63-64
    5.1.4 主要仪器  64
    5.1.5 主要试剂的配制  64
  5.2 实验方法  64-67
    5.2.1 实验虾料制备  64
    5.2.2 口服免疫实验  64-65
    5.2.3 总RNA的提取及检测  65
    5.2.4 cDNA的合成和检测  65
    5.2.5 目的片段的获取  65-66
    5.2.6 DNA 5’末端磷酸化  66
    5.2.7 目的片段的克隆  66
    5.2.8 阳性克隆子测序  66
    5.2.9 测序结果分析  66-67
  5.3 实验结果与分析  67-74
    5.3.1 目的片段的PCR扩增  67-68
    5.3.2 不同免疫刺激下LvDscam分子多样性分析  68-71
    5.3.3 B.subtilis-VP28引发的LvDscam特异性变构体可变区特征分析  71-74
  5.4 讨论  74-76
第6章 总结、创新和展望  76-79
  6.1 总结  76-77
  6.2 创新点  77
  6.3 展望  77-79
参考文献  79-86
致谢  86-87

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治 > 虾类
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