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牛支原体肺炎混合感染细菌学调查及多重PCR检测方法的建立

作　者: 肖淦文
导　师: 郭爱珍
学　校: 华中农业大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 牛支原体 混合感染 肺炎 多杀性巴氏杆菌 化脓隐秘杆菌 多重PCR
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


牛支原体肺炎是危害国内、外肉牛奶牛养殖业的一类重要疾病。该病的致病因子复杂,主要由牛支原体引起,但在环境应激因素刺激下可继发或并发多种细菌、病毒混合感染,从而引发以呼吸道症状为主的综合症候群。自从1961年美国科学家首次从患乳腺炎的病牛中分离到牛支原体以来,世界上绝大多数国家都有报道过牛支原体相关疾病的暴发。但迄今为止,各国科学家尚没有研发出有效药物和特异性疫苗来预防和治疗该病。我国于2008年首次报道了牛支原体肺炎的大规模暴发,之后证实在全国范围内广泛流行,经济损失严重。尤其在肉牛产业,由于异地育肥模式的兴起,牛群在不同地域间运输调动频繁,运输应激极大地加速了牛支原体肺炎在各地区的流行。为了阐明牛支原体肺炎的病原学特征,为临床上采取针对性治疗措施以及研发新型疫苗等预防措施提供理论依据,同时提供快速检测手段,本论文开展了如下研究：1.牛支原体肺炎混合感染细菌学调查本研究对近3年多来本实验室在全国范围内收集的、来自于35个临床初诊患牛支原体肺炎的牛场的123份病料进行了牛支原体及混合感染细菌的分离鉴定。结果证实：牛支原体感染占绝对优势,混合感染细菌主要以牛支原体合并多杀性巴氏杆菌A型感染、牛支原体合并化脓隐秘杆菌感染为主。这些结果为临床治疗与防控牛支原体肺炎提供了重要依据。2.牛支原体、多杀性巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌三重PCR检测方法的建立本试验在参考国内外文献的基础上,自行设计特异性扩增引物,优化反应条件和体系,建立了多重PCR检测方法。引物针对多杀性巴氏杆菌A型特异的hyaC—hyaD基因区段、化脓隐秘杆菌的16S rRNA基因上保守区段和牛支原体的UvrC基因,每个基因分别设计了6-10对引物,通过条件优化最终各筛选了1对引物,建立了可一次性鉴别与牛支原体混合感染的主要病原菌的多重PCR检测方法。特异性试验证明,该方法能同时扩增出多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和牛支原体3中致病菌的特异性片段,但其他非相关病原菌无扩增产物；该方法检测多杀性巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌的灵敏度为8×105CFU/mL,而检测牛支原体的灵敏度为4×106CFU/mL。多重PCR的敏感性较单一PCR降低了101-102倍；模拟临床样品和临床样品检测结果显示,多重PCR检测结果与分离鉴定方法一致,检测率可达80%以上。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略词  11-12
第1章 文献综述  12-26
  1.1 病原学  12-16
    1.1.1 牛支原体  12-14
    1.1.2 多杀性巴氏杆菌A型  14-15
    1.1.3 化脓隐秘杆菌  15-16
  1.2 流行病学及其危害  16-20
    1.2.1 牛支原体肺炎混合感染的流行与危害  16-17
    1.2.2 牛呼吸疾病综合征  17-18
    1.2.3 临床症状与病理变化  18-19
    1.2.4 牛支原体肺炎的致病机理及免疫应答反应  19-20
  1.3 诊断方法  20-24
    1.3.1 病原体分离鉴定  20-21
    1.3.2 血清学检测  21-22
    1.3.3 核酸检测  22-23
    1.3.4 毒力因子抗原抗体研究  23-24
  1.4 防治方法研究  24-26
第2章 牛支原体肺炎混合感染的细菌学调查  26-36
  2.1 研究目的和意义  26
  2.2 材料  26-28
    2.2.1 对照菌株  26
    2.2.2 试剂和培养基  26-27
    2.2.3 其他材料  27
    2.2.4 主要溶液及培养基的配制  27-28
    2.2.5 主要仪器设备  28
  2.3 方法  28-30
    2.3.1 病理解剖、组织样本及血清的采集  28-29
    2.3.2 病原分离培养与鉴定  29-30
  2.4 结果  30-34
  2.5 讨论  34-36
第3章 牛支原体、多杀性巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌3重PCR检测方法建立  36-51
  3.1 研究目的和意义  36
  3.2 材料  36-38
    3.2.1 对照标准菌株与病料  36
    3.2.2 试剂和培养基  36-37
    3.2.3 主要溶液及培养基的配制  37
    3.2.4 主要仪器设备  37-38
  3.3 方法  38-42
    3.3.1 样本的处理及基因组提取  38
    3.3.2 多重PCR引物设计  38-40
    3.3.3 多重PCR体系的建立  40-41
    3.3.4 PCR反应产物的检测  41
    3.3.5 单独各引物及多重PCR特异性评价  41
    3.3.6 单独各引物及多重PCR敏感性评价  41-42
    3.3.7 多重PCR样品检测  42
  3.4 结果  42-50
    3.4.1 多重PCR体系的确定  42-44
    3.4.2 PCR特异性评价结果  44-47
    3.4.3 PCR敏感性评价结果  47-49
    3.4.4 多重PCR样品检测结果  49-50
  3.5 讨论与分析  50-51
第4章 结论  51-52
参考文献  52-60
致谢  60-61
附录  61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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