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App菌影装载多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究

作　者: 孙颖
导　师: 金天明
学　校: 天津农学院
专　业: 预防兽医学
关键词: App 菌影多杀性巴氏杆菌 DNA疫苗 OmpH抗原
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪传染性胸膜肺炎与猪肺疫为猪场常见细菌性呼吸道传染病,常呈混合或继发感染,给养猪业带来巨大危害。生产实践中,接种疫苗是防治该病的最好方法。常用灭活苗对于异种血清型菌株感染不具保护作用,无法阻止菌体定殖,为生产实践带来一定困难。菌影疫苗是一种新型疫苗形式,制备过程中,膜表面抗原保留完好,可有效诱导体液免疫与细胞免疫。因此,菌影无论作为疫苗还是载体都具有广泛利用价值。本试验以噬菌体PhiX174基因组和金黄色葡萄球菌基因组为模板,通过PCR方法,扩增裂解蛋白E基因及核酸酶A基因(SN)。引物设计时加入linker序列,采用降落PCR方法实现E与SN基因的串联(E-15aalinker-SN)。将E基因与E-15aalinker-SN基因插入温控表达载体pBV220,构建温控单基因表达系统pBV-E和温控双基因表达系统pBV-E-15aalinker-SN。以pBV-E-15aalinker-SN质粒为模板,通过PCR方法对温控双基因裂解盒(DLS)进行扩增,构建重组克隆载体pMD-WK。酶切DLS,将其插入E. coli-App穿梭载体(pMC-Express),构建温控双基因裂解载体pMC-WK。裂解试验表明,E-15aalinker-SN裂解效果优于E,表现为裂解迅速而彻底,菌体裂解率可达99.999%;经PCR扩增的DLS具有生物学活性,表明DLS扩增成功。通过接合转化方式将pMC-WK导入胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App),成功制备出App菌影。以多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)基因组为模板,通过PCR方法扩增外膜蛋白ompH基因。以真核表达载体pCDNA3.1(+)为骨架,构建pCDNA-ompH。以其作为DNA疫苗,通过浸泡,将pCDNA-ompH质粒载入App菌影。小鼠免疫试验表明:App菌影装载pCDNA-ompH疫苗对猪胸膜肺炎放线杆菌与猪多杀性巴氏杆菌感染具有保护作用,保护率可达100%。

全文目录

摘要  12-13
Abstract  13-14
第一章引言  14-26
  1 研究目的和意义  14
  2 研究现状  14-25
    2.1 胸膜肺炎放线杆菌的研究现状  14-19
    2.2 多杀性巴氏杆菌的研究现状  19-21
    2.3 菌影  21-22
    2.4 DNA 疫苗  22-23
    2.5 粘膜免疫系统与粘膜免疫  23-25
  3 本研究的特色  25-26
第二章温控双基因裂解系统的构建  26-38
  1 材料和方法  26-33
    1.1 材料  26-27
    1.2 方法  27-33
  2 结果  33-37
    2.1 目的基因的扩增  33
    2.2 重组克隆质粒及其双酶切结果  33
    2.3 目的基因序列测定  33-36
    2.4 重组温控表达质粒及其双酶切结果  36
    2.5 温控双基因裂解盒（DLS）扩增结果  36
    2.6 DLS 重组克隆载体及双酶切结果  36-37
    2.7 载体示意图  37
  3 讨论  37
  4 小结  37-38
第三章温控双基因裂解系统生物学活性检测  38-47
  1 材料和方法  38-41
    1.1 材料  38-39
    1.2 方法  39-41
  2 结果  41-45
    2.1 裂解试验  41-44
    2.2 SDS-PAGE 试验  44-45
  3 讨论  45-46
    3.1 温控表达系统  45
    3.2 二价阳离子对菌影制备的影响  45-46
    3.3 菌影制备过程的有效监测方式  46
  4 小结  46-47
第四章 App 菌影的制备  47-53
  1 材料与方法  47-49
    1.1 材料  47-48
    1.2 方法  48-49
  2 结果  49-52
    2.1 重组穿梭载体酶切结果  49
    2.2 裂解试验结果  49-51
    2.3 载体示意图  51-52
  3 讨论  52
    3.1 转化方法的选择  52
    3.2 App (pMC-WK)的裂解特点  52
  4 小结  52-53
第五章多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH 真核表达载体的构建  53-56
  1 材料和方法  53-54
    1.1 材料  53
    1.2 方法  53-54
  2 结果  54-55
    2.1 ompH 扩增结果  54
    2.2 ompH 测序结果  54-55
    2.3 重组真核表达载体pCDNA-ompH 及其双酶切结果  55
    2.4 质粒示意图  55
  3 讨论  55
  4 小结  55-56
第六章疫苗免疫效果评价  56-60
  1 材料和方法  56-57
    1.1 材料  56
    1.2 方法  56-57
  2 结果  57-59
    2.1 App 感染对小鼠最小致死量的测定结果  57-58
    2.2 Pm 感染对小鼠最小致死量的测定结果  58
    2.3 无菌检验  58
    2.4 安全性检验  58
    2.5 疫苗保护效果比较结果  58-59
  3 讨论  59
    3.1 菌影产物安全性  59
    3.2 菌影的佐剂特性  59
  4 小结  59-60
第七章结论  60-61
参考文献  61-66
附录  66-67
致谢  67-68
攻读硕士学位期间发表的论文  68

App菌影装载多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究

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