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牛支原体灭活疫苗佐剂的筛选与培养基的改良

作　者: 石刚
导　师: 剡根强
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛支原体疫苗佐剂 ELISA 改良培养基最小抑菌浓度（MIC）
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 2次
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内容摘要

牛支原体(Mycoplasmabovis，M.bovis)是引起犊牛肺炎、关节炎和奶牛乳房炎的主要病原体，近年来，由牛支原体感染引起的相关疾病已蔓延至全世界，2010年以来，新疆北疆部分地区规模化牛场犊牛陆续出现严重的肺炎与关节炎，造成大批犊牛死亡，后经实验室诊断确定病原体为牛支原体。目前，国内尚无预防该病的商品化疫苗供生产应用，而抗生素治疗常存在盲目用药，疗效不确定等情况。为了解决上述问题本试验着重开展了以下研究：1.将分离并鉴定得到的牛支原体新疆分离菌株进行扩大培养制备灭活菌悬液，然后分别与弗氏完全佐剂、白油佐剂、氢氧化铝佐剂、蜂胶佐剂配合，制成灭活疫苗免疫小鼠，通过测定血清中的抗体水平来筛选免疫效果较好的疫苗佐剂。结果表明白油佐剂组的免疫增强效果最佳，产生的抗体水平最高，并且高抗体水平持续时间较长，可以作为牛支原体灭活疫苗的较理想佐剂。2.在常用牛心汤培养基基础上进行了改良，将配方中原有牛心汤进行了2倍浓缩并加入了DMEM和牛肺消化液，利用活菌计数法、菌体蛋白测定法、OD值测定法对牛支原体新疆分离株在改良后的液体培养基中不同培养阶段的生长滴度即颜色变化单位（CCU）、菌体蛋白量及OD值进行了测定，并采用平板菌落计数法（CFU）对牛支原体新疆分离株在三种固体培养基中的菌落数进行了测定。结果表明改良后的培养基配方培养效率明显提高，有助于牛支原体的大量培养。3.选择临床常用的恩诺沙星、乳酸环丙沙星、盐酸林可霉素、泰乐菌素、阿奇霉素、替米考星、氧氟沙星、氟苯尼考八种药物，采用两倍稀释法对牛支原体进行体外最小抑菌浓度的测定，为指导临床合理用药提供依据。结果表明牛支原体对恩诺沙星的耐药性最低，适用于当前治疗牛支原体感染性疾病。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
主要缩略词  7-8
目录  8-11
引言  11-13
第一章文献综述牛支原体研究概况  13-24
  1 支原体研究概况  13-15
    1.1 支原体培养特性  13
    1.2 支原体形态特征  13-14
    1.3 支原体的致病性  14
    1.4 支原体的抗原结构  14
    1.5 支原体的抵抗力  14-15
  2 主要畜禽支原体  15-16
    2.1 牛肺疫  15
    2.2 猪喘气病  15
    2.3 鸡慢性呼吸道疾病  15-16
    2.4 山羊传染性胸膜肺炎  16
  3 牛支原体研究进展  16-24
    3.1 流行病学  16-17
    3.2 病原学  17
    3.3 致病性  17-18
      3.3.1 毒力因子  17-18
      3.3.2 牛支原体诱导的免疫反应  18
    3.4 临床症状与病理变化  18-19
      3.4.1 临床症状  18-19
      3.4.2 病理变化  19
    3.5 鉴别诊断  19-21
      3.5.1 病原分离鉴定  19
      3.5.2 血清学诊断  19-20
      3.5.3 基因诊断  20-21
    3.6 感染模型  21
    3.7 疫病防控  21-22
      3.7.1 加强检疫监管  21
      3.7.2 严格封锁和隔离  21
      3.7.3 认真做好消毒灭源  21
      3.7.4 加强饲养管理  21-22
    3.8 疫苗研制  22
    3.9 结语  22-24
第二章试验研究  24-45
  试验一牛支原体灭活疫苗免疫小鼠最佳免疫剂量的研究  24-27
    1 材料与方法  24-25
      1.1 材料  24
      1.2 设备  24
      1.3 免疫方法  24
      1.4 IHA检测血清血凝效价  24-25
        1.4.1 抗原制备  24-25
        1.4.2 绵羊红细胞采集  25
        1.4.3 红细胞的醛化、鞣酸化和抗原致敏  25
        1.4.4 IHA操作步骤与判定标准  25
    2 结果与分析  25-26
    3 讨论  26
    4 小结  26-27
  试验二四种佐剂对牛支原体灭活疫苗免疫小鼠抗体水平的研究  27-35
    1. 材料与方法  27-29
      1.1 材料  27-29
        1.1.1 试验菌株及试验动物  27
        1.1.2 培养基  27-28
        1.1.3 设备  28
        1.1.4 佐剂及其制备  28
        1.1.5 ELISA检测主要试剂  28-29
    2 方法  29-31
      2.1 抗原制备  29
      2.2 牛支原体灭活佐剂疫苗的制备  29
      2.3 免疫方法及血样采集  29-30
      2.4 ELISA检测血清抗体效价  30-31
        2.4.1 包被抗原的制备  30
        2.4.2 阴性血清制备  30
        2.4.3 阳性血清制备  30
        2.4.4 酶标板预处理  30
        2.4.5 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数测定  30
        2.4.6 酶标二抗最佳工作浓度的确定  30-31
        2.4.7 临界值的确定  31
        2.4.8 抗体效价检测  31
    3 结果与分析  31-33
      3.1 疫苗稳定性及无菌检验  31
      3.2 疫苗安全性检验  31
      3.3 抗原、血清最佳工作浓度  31-32
      3.4 酶标二抗最佳工作浓度  32
      3.5 临界值的确定  32
      3.6 疫苗抗体水平检测  32-33
    4 讨论  33-34
      4.1 不同佐剂疫苗免疫部位的局部反应  33
      4.2 不同佐剂疫苗抗体水平的差异  33-34
    5 小结  34-35
  试验三牛支原体常用牛心汤培养基的改良极其培养效果研究  35-41
    1 材料和方法  35-37
      1.1 菌株  35
      1.2 仪器  35
      1.3 培养基  35-36
      1.4 菌种的复苏  36
      1.5 活菌计数CCU的测定  36
      1.6 菌体蛋白测定  36
      1.7 OD值的测定  36
      1.8 平板菌落计数CFU的测定  36-37
    2 结果与分析  37-39
      2.1 活菌计数CCU结果  37-38
      2.2 菌体蛋白测定结果  38
      2.3 OD值测定结果  38
      2.4 平板菌落计数CFU的测定结果  38-39
    3 讨论  39-40
    4 小结  40-41
  试验四八种抗菌药物对牛支原体的体外最小抑菌浓度研究  41-45
    1. 材料与方法  41-42
      1.1 药品试剂  41
      1.2 培养基  41
      1.3 仪器  41
      1.4 菌种  41-42
      1.5 颜色变化单位（CCU）的测定  42
      1.6 最小抑菌浓度（MIC）的测定  42
    2 结果与分析  42-43
      2.1 颜色变化单位（CCU）的测定  42
      2.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定  42-43
    3 讨论  43-44
    4 小结  44-45
第三章论文结论与创新点  45-46
  论文结论  45
  创新点  45-46
参考文献  46-52
致谢  52-53
作者简介  53-54
导师评阅表  54

牛支原体灭活疫苗佐剂的筛选与培养基的改良

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