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激流式生物反应器大规模培养IBDV及制备高效灭活疫苗的研究

作　者: 周欣
导　师: 杨霞; 王川庆
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: IBDV DF-1细胞 激流式生物反应器 种毒库 IBD疫苗
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease Virus，IBD）是由IBD病毒（IBDV）引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。该病自20世纪80年代传入我国，至今仍是危害最为严重的禽病之一。目前，该病主要通过疫苗接种来防控。除给雏鸡使用活疫苗免疫外，通常还给种鸡注射灭活疫苗使雏鸡获得高的母源抗体，以保护其在生命早期不感染传染性法氏囊病病。国内鸡传染性法氏囊病灭活疫苗通常是采用鸡胚成纤维细胞培养病毒制备而成，免疫效果差，在生产中应用效果不好。目前，国内各大种鸡场大多采用进口灭活疫苗。近年来，生物反应器大规模培养技术逐渐用于兽用生物制品。但目前对IBDV的研究不多，国内也有利用Vero细胞在生物反应器上增殖IBDV的报道，但是，没能得到应用。根据研究鸡传染性法氏囊病高效灭活疫苗的需要，本研究采用鸡胚源DF-1细胞系，通过生物反应器中微载体悬浮培养，获得比传统培养方法提高100倍的高效价病毒抗原，并用其成功研制了一种优质、高效的法氏囊灭活疫苗，以满足市场的需要。研究结果如下：1根据高效培养IBDV对于病毒滴度检测的需要，针对鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物，以所构建的重组质粒作为阳性标准品，成功建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量RT-PCR(QRT-PCR)方法。应用该方法和经典TCID50方法初步对IBDV在方瓶中增殖动态的测定结果表明，两种方法测定的方瓶DF-1细胞中IBDV的增殖曲线具有一定的平行关系，但QRT-PCR方法（4h）比TCID50方法（3-4d）更快速和敏感。2应用所建立的QRT-PCR方法首次对微载体转管微型反应器和AP10生物反应器培养的DF-1细胞中IBDV的增殖特性进行了较为系统的研究，并与经典的TCID50测定法进行了比较。结果表明：①转管（内置0.6g纸片载体）中接种3×107个DF-1细胞，培养144h细胞可增至最大值2.4～2.5×108个，为最佳接毒时间；最佳接毒剂量为0.79MOI，最佳收毒时间为接毒后的28h；上清和全悬液毒价呈平行关系，但后者更高，可达9.5(-lgTCID50/mL)以上（为转瓶毒价的10倍）。②转管中细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系，在细胞生长期内（144h）平均每个细胞耗糖量为6.5×10-10g/24h，可根据糖耗量推测细胞生长状态和数量；接毒后糖耗速率的高峰要先于病毒滴度的高峰，在糖耗高峰出现后下降至趋于零的瞬间收获，可获得较高毒价的病毒液。③在转管培养毒价高峰时收获1/3毒液后9h，收获1/2毒液后18h可再次获得最高毒价的毒液；④反应器中接毒剂量为1.05MOI时，接毒后24h最高毒价达到9.5(-lgTCID50/mL)；1/2换液后8h最高毒价只达到9.25(-lgTCID50/mL）。⑤反应器中糖耗高峰比毒价高峰早，在耗糖量下降为0的左右病毒毒价达到高峰，但是毒价高峰与接毒时的细胞数和接毒剂量有关。⑥荧光定量测定的高密度培养条件下IBDV毒价的上升和下降趋势及高峰的时间与TCID50测定结果基本一致，但荧光定量方法更快速和敏感。3用IBDV细胞毒HQ株在鸡胚源DF-1细胞系上连续传10代，并对10代内的细胞毒液分别进行了病毒含量测定及免疫原性、特异性、保存期和纯净性的鉴定，证明在10代内HQ株细胞毒的上述特性基本一致，从而建立了IBDV HQ株的生产种子批。将IBDV HQ株反应器DF-1细胞培养液（109.5TCID50/mL）、转瓶DF-1（108.5TCID50/mL，3倍浓缩）及CEF细胞培养液（107.5TCID50/mL，5倍浓缩）按试行规程制备灭活疫苗，并进行各项检验。结果表明，其半成品及成品检验（物理性状检验、无菌检验、安全试验）均符合规程要求。三种疫苗免疫原性检验结果显示，DF-1细胞反应器疫苗中和抗体明显高于转瓶苗，攻毒保护免疫组两种DF-1疫苗都为100℅保护，对照组保护率为0，CEF苗中和抗和攻毒保护都较DF-1苗低。本研究通过利用转管载体微型反应器进行DF-1细胞高密度培养，在自动控制的生物反应器中进行IBDV最佳培养条件和收毒方式的探索，从而为工厂化大规模培养IBDV及制备高效灭活疫苗提供理论依据和实践经验，因而具有很大的实用性。

全文目录


致谢  5-8
摘要  8-10
文献综述  10-23
  1 传染性法氏囊病概述  10-11
    1.1 传染性法氏囊病的发现  10
    1.2 传染性法氏囊病的生物学特征  10
    1.3 传染性法氏囊病流行现状  10-11
  2 传染性法氏囊病毒分子生物学研究进展  11-12
  3 传染性法氏囊病检测方法的研究进展  12-13
    3.1 IBD 常规检测方法及应用  12-13
    3.2 IBD 分子生物学检测方法研究进展  13
  4 动物细胞大规模培养技术的研究进展  13-19
    4.1 动物细胞培养及常用的细胞系  13-14
    4.2 微载体及其培养技术的发展  14-15
    4.3 生物反应器的种类及应用  15-16
    4.4 生物反应器微载体大规模培养动物细胞的现状  16-17
    4.5 安普激流灌注式生物反应器的应用  17-19
  5 传染性法氏囊病疫苗研究进展  19-23
    5.1 传统疫苗的研究及应用  19-20
    5.2 新型疫苗研究进展  20-23
试验一 传染性法氏囊病毒实时 QRT-PCR 检测方法的建立  23-32
  1 材料与方法  23-24
    1.1 主要仪器  23
    1.2 主要试剂和材料  23
    1.3 细胞系和病毒株  23-24
  2 方法  24-25
    2.1 引物设计  24
    2.2 病毒 RNA 的提取和 cDNA 的合成  24
    2.3 标准品的制备  24
    2.4 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立  24-25
    2.5 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 的敏感性、特异性及重复性实验  25
    2.6 实时 QRT-PCR 检测方法对 IBDV 在方瓶 DF-1 细胞中增殖动态的测定  25
  3 结果  25-30
    3.1 标准质粒 p-18T-493 的构建  25-26
    3.2 标准曲线的建立  26
    3.3 SYBR GreenⅠ荧光定量敏感性实验  26-27
    3.4 SYBR GreenⅠ荧光定量特异性实验  27-28
    3.5 SYBR GreenⅠ荧光定量重复性实验  28-29
    3.6 QRT-PCR 和 TCID50方法对 IBDV 在方瓶中增殖动态的测定  29-30
  4 讨论  30-32
实验二、用激流式生物反应器大规模培养传染性法氏囊病毒的研究  32-55
  1 材料  32-33
    1.1 主要仪器  32
    1.2 主要材料  32-33
    1.3 细胞与病毒种毒  33
    1.4 实验场地  33
  2 方法  33-36
    2.1 IBDV 在微型反应器（转管纸片载体）DF-1 细胞上培养特性的研究  33-35
    2.2 IBDV 在 AP10 激流式生物反应器中 DF-1 细胞上繁殖特性的研究  35-36
  3 结果  36-52
    3.1 转管中 DF-1 细胞的生长动态和糖耗测定  36-38
    3.2 IBDV 在转管 DF-1 细胞中接毒量(MOI)和收毒时间的确定  38-39
    3.3 IBDV 在转管(纸片载体)DF-1 细胞中的繁殖动态  39-43
    3.4 IBDV 在转管(纸片载体)DF-1 细胞中二次收毒测定  43-44
    3.5 激流式生物反应器中 IBDV 增殖动态的测定  44-48
    3.6 激流式生物反应器中 IBDV 二次收毒实验  48-52
  4 讨论  52-55
试验三 用反应器和转瓶培养 IBDV 制备灭活疫苗的研究  55-69
  1 材料  55-56
    1.1 主要仪器  55
    1.2 主要试剂和材料  55-56
    1.3 细胞与病毒  56
    1.4 试验用 SPF 鸡　  56
  2 方法  56-59
    2.1 IBDV HQ 株在 DF-1 细胞系上种毒库的建立和鉴定  56-57
    2.2 IBDCEF 细胞、DF-1 细胞转瓶及反应器 DF-1 细胞灭活疫苗的制备及检验  57-59
  3 结果  59-67
    3.1 IBDV HQ 株在 DF-1 细胞系上种毒库的建立和鉴定结果  59-62
      3.1.1 病毒含量的测定  59
      3.1.2 特异性测定  59-60
      3.1.3 纯净度检验  60-61
      3.1.4 免疫原性测定  61-62
      3.1.5 保存期的测定  62
    3.2 转瓶 CEF 细胞、DF-1 细胞及反应器 DF-1 细胞 IBD 疫苗的制备和检验  62-67
      3.2.1 反应器病毒液的制备  62-63
      3.2.2 转瓶 CEF 细胞和 DF-1 细胞 IBD 病毒液的制备及浓缩试验结果  63
      3.2.3 IBD 三种病毒液的灭活和检验  63-64
      3.2.4 IBD 三种疫苗的乳化与分装  64
      3.2.5 IBD 三种疫苗的检验结果  64-67
  4 讨论  67-69
参考文献  69-74
英文摘要  74-75

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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