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IBDV VP2/4/3与ChIL-18融合和共表达真核表达质粒的构建及其免疫原性研究

作　者: 侯贤宏
导　师: 于涟；方维焕
学　校: 浙江大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性法氏囊病病毒(IBDV) 鸡白细胞介素18 基因融合 基因共表达 DNA疫苗 免疫原性
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官-法氏囊,导致免疫抑制。用弱毒苗和灭活苗免疫鸡群是目前防治IBD的主要方法,但随着IBDV变异株与超强毒株的出现,免疫失败时有发生。DNA疫苗因能诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答而成为疫苗学研究的热点,但由于其诱导产生的免疫应答效果还不够理想,因此如何增强其免疫效果成为目前DNA疫苗的关键问题。本研究小组在前期工作中已证实了IBDV多聚蛋白(VP2/4/3) DNA疫苗具有良好的免疫原性,可诱发机体产生满意的保护效果,而且鸡白细胞介素18(Chicken Interleukin 18, ChIL-18)能够增强IBDV DNA疫苗免疫效果。为进一步提高IBDV多聚蛋白(VP2/4/3) DNA疫苗的免疫效果,本研究应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension)将IBDV VP2/4/3基因与鸡ChIL-18基因融合在一起,得到融合基因片段VP2/4/3-ChIL-18和ChIL-18-VP2/4/3,将融合基因片段定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18和pCI-ChIL-18-VP2/4/3;应用PCR法,在本实验室已成功构建的重组真核表达质粒pCI-VP2/4/3和pCI-ChIL-18的基础上,构建VP2/4/3基因和ChIL-18基因的共表达质粒co-pCI-VP2/4/3-ChIL-18质粒,该质粒含有2个独立的转录单元(ChIL-18和IBDV VP2/4/3),可以同时独立的表达这2种蛋白。在脂质体介导下将上述重组真核表达载体转染Vero细胞,间接免疫荧光证实重组质粒能正确表达目的蛋白,表达的蛋白具有免疫反应性。将2周龄SPF鸡随机分为6组,以200μg/羽剂量首免：A组免疫重组真核表达质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18, B组免疫pCI-ChIL-18-VP2/4/3, C组免疫co-pCI-VP2/4/3-ChIL-18, D组免疫pCI-VP2/4/3, E组免疫pCI-ChIL-18+ pCI-VP2/4/3, F组为空白对照,2周后以相同剂量2免,通过观察外周血淋巴细胞增殖效果,测定血清IBDV中和抗体水平、血清ELISA抗体水平和攻毒保护试验等,比较各试验组IBDV DNA疫苗的免疫原性。结果表明重组质粒co-pCI-VP2/4/3-ChIL-18的免疫效果最好,pCI-VP2/4/3-ChIL-18免疫效果次之,pCI-ChIL-18-VP2/4/3与pCI-ChIL-18+pCI-VP2/4/3的免疫效果无显著差异,但均优于单独使用重组质粒pCI-VP2/4/3组。本研究成功构建了融合基因真核表达质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18、pCI-ChIL-18-VP2/4/3和基因共表达质粒co-pCI-VP2/4/3-ChIL-18,并且在Vero细胞中得到了正确表达,表达产物具有免疫反应性。ChIL-18与IBDV VP2/4/3相互间能发生协同作用,增强DNA疫苗的免疫效果。与IBDV多聚蛋白DNA疫苗和ChIL-18联合免疫相比,采用基因重组质粒进行免疫还有一针注射,方便操作,降低成本等优点。为进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用及研制高效、价廉的IBDV DNA疫苗提供了实验依据。

全文目录


中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
第一部分 文献综述  12-54
  第一章 与疫苗有关的IBDV分子生物学研究进展  13-29
    1 病毒的基因组结构  14-15
    2 病毒的形态结构  15-16
    3 与疫苗有关的病毒蛋白  16-22
    4 IBDV基因工程苗及DNA疫苗的研究  22-23
    参考文献  23-29
  第二章 DNA疫苗的研究进展  29-44
    1 DNA疫苗的作用机制  29-31
    2 构建DNA疫苗的载体结构  31-32
    3 DNA疫苗的投递方式  32-34
    4 DNA疫苗用于传染病防控的优势  34-36
    5 增强DNA疫苗免疫效果的有效途径  36-38
    6 DNA疫苗在兽医学领域的应用  38-39
    7 DNA疫苗目前存在的主要问题  39-40
    参考文献  40-44
  第三章 白细胞介素18的研究进展  44-54
    1 IL-18的产生及分布  45-47
    2 IL-18的分子结构  47-48
    3 IL-18受体  48
    4 IL-18的生物学功能  48-50
    5 IL-18的应用性研究  50-51
    参考文献  51-54
第二部分 研究内容  54-100
  第一章 IBDV VP2/4/3、ChIL-18融合基因表达质粒的构建及在Vero细胞上的表达  55-73
    摘要  55
    Abstract  55-56
    1 材料  56-57
    2 方法  57-68
    3 结果  68-70
    4 讨论  70-71
    参考文献  71-73
  第二章 IBDV VP2/4/3、ChIL-18基因共表达质粒的构建及在Vero细胞上的表达  73-86
    摘要  73
    Abstract  73-74
    1 材料  74
    2 方法  74-81
    3 结果  81-83
    4 讨论  83-85
    参考文献  85-86
  第三章 IBDV VP2/4/3与ChIL-18融合基因真核表达质粒和基因共表达质粒的免疫原性研究  86-100
    摘要  86
    Abstract  86-88
    1 材料  88
    2 方法  88-92
    3 结果  92-96
    4 讨论  96-98
    参考文献  98-100
第三部分 总结与展望  100-103
  1 总结  101
  2 不足  101-102
  3 展望  102-103
第四部分 附录  103-110
  附录1 本试验所用的质粒图谱  104-105
  附录2 常用缓冲液及试剂  105-109
  附录3 硕士期间参与的课题及发表的论文  109-110
致谢  110

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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