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DF-1细胞分泌的外源体（Exosomes）在ALV-J免疫抑制中的作用

作　者: 陈洪博
导　师: 成子强
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: DF-1细胞 ALV-J Exosomes 相互作用免疫抑制
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)是禽白血病/肉瘤病毒群的一个新亚群,是由英国人Payne于1991首次报道,其主要引起肉种鸡的髓细胞瘤(Myelcytomatosis,ML)。近年来ALV-J在世界范围内迅速传播,尤其是在1997-1998年对世界养禽业造成了毁灭性的打击。ALV-J是由内源性和外源性禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)重组而来,自发现以来给养禽业造成了巨大的经济损失。ALV-J除可导致ML并引起感染鸡群死亡外,更值得我们注意的是它的免疫抑制作用,这也是绝大数感染鸡群的主要表现形式,由于ALV-J的感染,鸡群的生产性能大为降低,对疫苗的免疫应答水平降低,导致继发感染其它疾病,引起更重大经济损失。因此,对ALV-J造成免疫抑制的机制及其相关影响因素的研究,对进一步ALV-J的防控研究具有重要意义。自1987年Johnstone等人发现网织红细胞向成熟红细胞转变过程中释放一种名为外源体(Exosome)的微囊泡之后,Exosome已被越来越多的人进行研究。Exosome来源于细胞内吞途径中的多囊体(Multivesicularbody,MVB),它除了可由网织红细胞分泌之外,还可由诸如各种血细胞、上皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞(如黑色素瘤、肺癌、间皮瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病细胞)等多种细胞分泌。近几年,研究发现Exosomes的分泌与反转录病毒出芽之间存在一定的联系,例如人巨细胞病毒(HCMV)蛋白US28主要存在于MVB中,通过HCMV病毒装配与病毒包膜组合在一起;HIV-1出芽依赖Tsg101(一种在MVB形成过程中很重要的蛋白)。反转录病毒在浆膜向外出芽方式与MVB向内出芽一样,都是胞膜包裹胞质内陷,这样反转录病毒似乎与经修饰的MVB内囊泡(比如Exosome)一样,有可能通过MVB与浆膜融合释放到细胞外环境。于是,我们推测病毒感染细胞分泌的Exosome可能携带了某些病毒蛋白,在细胞信号转导中传递了病毒的组成成分,造成细胞对病毒识别的丧失,从而使病毒能够顺利的在细胞内复制及传播。本研究以ALV-J为模式病毒,研究其感染细胞分泌的Exosome在免疫抑制中的作用。采用分级离心和密度梯度离心的方法,从ALV-J感染DF-1细胞及正常DF-1细胞培养基中提取Exosomes,利用电镜技术和免疫印迹分析对其进行鉴定。结果显示,从DF-1细胞培养基中提取的Exosomes主要分布在1.13-1.21g/ml密度层之间,平均直径在30-100 nm之间,呈杯状,这与相关报道关于其它细胞分泌的Exosomes特征一致。分别提取等量两种细胞上清液,经BCA蛋白定量后发现ALV-J感染Exosome浓度为正常Exosome浓度的63倍,表明ALV-J感染对Exosome的分泌有重要影响。利用免疫印迹方法,分析DF-1细胞释放ALV-J与其分泌Exosomes之间的关系。结果显示,从正常DF-1细胞和接种ALV-J的DF-1细胞系培养基中提取的Exosomes蛋白组成复杂,蛋白分子量在20-200kD之间,两种Exosome成分之间有相同之处,但也存在差异;Hsp70等标志性蛋白存在于所提取的Exosomes上;用兔抗ALV-J GP85多克隆抗体可以检测到ALV-J感染DF-1细胞Exosome出现阳性条带,条带分子量大小为70kD左右,而DF-1细胞上清液中提取的Exosome检测不到条带,表明DF-1细胞分泌的Exosome携带了病毒的SU蛋白或SU蛋白的一部分; ISU片段是TM内高度保守的免疫抑制序列,具有免疫抑制作用,能够抑制淋巴细胞的分化,用兔抗ISU肽多克隆抗体正常DF-1细胞Exosome和ALV-J感染DF-1细胞来源的Exosome均可在74kD左右出现阳性条带,表明TM蛋白ISU区域或能与ISU多肽结合的物质也包含在Exosome的囊泡内,而这种物质是正常DF-1细胞分泌的,ALV-J感染细胞后并不影响它的生成。上述结果表明,正常DF-1细胞和ALV-J感染DF-1细胞系可以分泌Exosomes,ALV-J感染DF-1细胞释放的Exosome携带有ALV-J病毒的表面蛋白和跨膜蛋白高度保守区域,根据Exosome自身所具有的远程信号传导功能,我们确定Exosome在ALV-J所造成的免疫抑制过程中起信号传递作用。

全文目录

英文缩略表  7-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-13
1 引言  13-31
  1.1 禽白血病病毒的研究现状  13-19
    1.1.1 J 亚群禽白血病  14-15
    1.1.2 ALV-J 的分子病毒学特性  15-17
    1.1.3 ALV-J 流行病学  17-18
    1.1.4 ALV-J 的诊断  18-19
    1.1.5 ALV-J 的防制  19
  1.2 J 亚群禽白血病病毒引起的免疫抑制  19-21
    1.2.1 免疫抑制的危害  19-20
    1.2.2 免疫抑制的主要机理  20
    1.2.3 ALV-J 免疫抑制机理的研究现状  20-21
  1.3 Exosome 的生物学起源和功能  21-29
    1.3.1 Exosomes 的形成  21-22
    1.3.2 MVBs 膜与细胞膜的融合和Exosomes 的分泌  22-23
    1.3.3 Exosomes 的分子组成  23-25
    1.3.4 Exosomes 的生理学功能  25-27
    1.3.5 转运病毒  27-28
    1.3.6 Exosomes 与ALV-J 相关蛋白间的关系  28-29
  1.4 研究展望  29-31
2 材料与方法  31-42
  2.1 试剂与仪器  31-37
    2.1.1 主要试剂材料  31-35
    2.1.2 抗体  35-36
    2.1.3 主要仪器  36
    2.1.4 试验地点  36-37
  2.2 方法  37-42
    2.2.1 DF-1 细胞复苏  37
    2.2.2 NX0101 病毒TCID_(50) 的测定  37
    2.2.3 DF-1 细胞传代培养  37-38
    2.2.4 NX0101 病毒感染DF-1 细胞  38
    2.2.5 间接免疫荧光反应  38
    2.2.6 NX0101 前病毒DNA 的抽提  38-39
    2.2.7 PCR  39
    2.2.8 ELISA  39
    2.2.9 细胞上清液收集  39-40
    2.2.10 Exosomes 的提取纯化  40
    2.2.11 负染  40
    2.2.12 Western blotting 分析  40-42
3 结果  42-51
  3.1 DF-1 细胞的形态  42
  3.2 NX0101 病毒TCID_(50) 结果  42-43
  3.3 间接免疫荧光检测感染细胞  43-44
  3.4 PCR 结果  44-45
  3.5 ELISA 结果  45
  3.6 Exosome 蔗糖梯度离心结果  45-46
  3.7 BCA 检测提取Exosome 的浓度  46-47
  3.8 Exosome 电镜结果  47-48
  3.9 SDS-Page 电泳观察Exosome 组分  48-49
  3.10 Western Blot 分析Exosome 蛋白组分  49-51
4 讨论与小结  51-55
  4.1 ALV-J 感染DF-1 细胞细胞的培养  51-52
  4.2 ALV-J 感染DF-1 细胞分泌Exosomes 的分离与鉴定  52-55
5 创新  55-56
参考文献  56-63
致谢  63-64
作者简介及攻读硕士学位发表论文?  64-65
附件  65

DF-1细胞分泌的外源体（Exosomes）在ALV-J免疫抑制中的作用

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