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CLASSⅠ新城疫病毒感染鸡成纤维细胞的时相变化研究

作　者: 孙英杰
导　师: 丁铲
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒 ClassⅠ 时相变化 DF-1细胞蛋白组学
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是副黏病毒科、禽腮腺炎病毒属唯一成员,可以感染200余种禽类和哺乳动物,一直是危害世界养禽业的最主要病患之一。根据系统发育进化树分析,可将不同基因组长度的NDV病毒分为两个群,即ClassⅠ(15198nt)和ClassⅡ(15192nt或15186nt)。其中,Class I毒株主要感染水禽和鸟类,这类毒株在该疫病的流行病学和致病机制研究中的重要性一直被人们忽视。本课题组在早期研究中发现一株水禽源NDV Class I毒株,经鸡体传代后,由无毒株(avirulent)演化为强毒株(velogenic),其基因组长度仍为15198nt。为了进一步研究该水禽源NDV对鸡的致病机制和进化适应机理,本文利用该ClassⅠ新城疫病毒强毒株定量感染鸡0系成纤维细胞系(DF-1),通过对感染后各时间点病毒滴度、结构蛋白定位、结构蛋白mRNA水平、细胞骨架和蛋白组学的变化,综合评价ClassⅠ新城疫病毒感染鸡体细胞后的时相情况,对系统地掌握NDV在鸡体细胞中的增殖过程和感染机制具有重要的理论意义。一、Class I新城疫病毒各结构蛋白抗体制备本研究以新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒离株9a5b尿囊液以及原核表达的NP、P、M、HN、F五种重组蛋白为免疫原,接种6周龄BALB/c小鼠制备抗体,用血凝抑制试验(HI)、间接免疫荧光试验(IFA)、细胞中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-blot方法共同检测所获得的抗体。结果显示,成功制备获得了NDV各结构蛋白多抗及12株NDV特异性单抗。免疫特性鉴定结果表明,在获得的12株单抗中,3株为抗ClassⅠNDV特异性单抗(2A8、3H7和3H9),其中,3H7和3H9为HN特异性单抗,仅具有IFA和HI效价;其他9株单抗均与ClassⅡ毒株存在交叉反应。二、ClassⅠN DV强毒株9a5b感染DF1后时相变化研究本研究将9a5b毒株按5m.o.i量感染DF-1细胞,分别于不同时间点收获细胞以及培养上清,利用荧光定量RT-PCR、Western-blot、IFA等方法对病毒结构蛋白mRNA转录水平、蛋白含量及蛋白定位情况进行系统研究。荧光定量RT-PCR结果显示:各结构蛋白mRNA变化与该病毒的生长曲线基本一致;Western-blot和IFA检测结果显示:9a5b病毒感染DF-1后1h就能在细胞浆中检测出NP、P蛋白的存在,其余4种主要蛋白(M、F、HN、L)出现的时间相对较晚,所有病毒蛋白在不同的时间点有着各自特定的定位方式;通过对细胞actin和内质网的染色发现:9a5b病毒感染对这两者的影响并不显著。三、ClassⅠNDV感染CEF蛋白组学初步研究本研究将9a5b、1a毒株按0.001M.O.I.量感染CEF细胞,于感染后12h收获细胞,进行差异蛋白组学研究,结果显示:对1a感染组与CEF对照组利用ImageMasterTM对2-D图谱比较后经质谱分析共检测到差异蛋白点41个其中上调蛋白点13个,下调蛋白点28个,选取其中的11个点进行初步鉴定,成功鉴定出7种蛋白质,对差异蛋白中有重要意义蛋白质的功能进行初步探讨。本研究首次对CLASSⅠNDV感染禽成纤维细胞的时相变化和蛋白组学进行研究,系统的阐述了NDV感染细胞后病毒增殖过程。这为深入开展各蛋白与该病毒的致病机制、毒力演化规律及其与宿主相互作用和进化适应性机制的研究工作奠定了基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章引言  13-20
  1.1 NDV病原学研究进展  13-18
    1.1.1 NDV概述  13
    1.1.2 NDV的形态结构  13-14
    1.1.3 基因组结构  14-15
    1.1.4 病毒蛋白  15-17
    1.1.5 NDV复制周期  17-18
  1.2 副粘病毒与宿主细胞相互作用研究进展  18-19
  1.3 本研究的目的与意义  19-20
第二章 Class ⅠN DV各结构蛋白特异性抗体的研制  20-40
  2.1 材料和方法  20-25
    2.1.1 病毒  20-21
    2.1.2 实验动物及细胞系  21
    2.1.3 载体和主要试剂  21
    2.1.4 主要仪器  21
    2.1.5 主要缓冲液及试剂配制  21-22
    2.1.6 免疫用抗原制备  22-23
    2.1.7 多抗血清的制备  23
    2.1.8 单克隆抗体的制备  23-24
    2.1.9 单抗特性鉴定  24-25
  2.2 结果  25-36
    2.2.1 RT-PCR结果  25
    2.2.2 HN基因测序结果  25
    2.2.3 含有NP、P、M、F、HN基因原核表达和真核表达质粒的构建与鉴定  25-29
    2.2.4 原核表达  29
    2.2.5 含有NP、P、M、F、HN基因真核表达质粒的构建与鉴定  29-30
    2.2.6 制备获得NDV多抗和单因子血清  30-31
    2.2.7 全病毒免疫制备获得8 株单抗  31-35
    2.2.8 P蛋白纯化产物免疫获得4 株单抗  35-36
  2.3 讨论  36-40
    2.3.1 关于NDV抗体  36-37
    2.3.2 关于NDV HN的受体结合位点  37-40
第三章 ClassⅠ N DV强毒株 9a5b 感染 DF1 的时相变化研究  40-54
  3.1 材料和方法  40-44
    3.1.1 病毒  40
    3.1.2 实验动物及细胞系  40
    3.1.3 载体和主要试剂  40
    3.1.4 主要仪器  40
    3.1.5 主要缓冲液及试剂配制  40-41
    3.1.6 NDV 9a5b 在 DF-1 细胞中的一步生长曲线  41-42
    3.1.7 Western-blot检测病毒结构蛋白量的时相变化  42
    3.1.8 Real-time RT-PCR 分析 9a5b 病毒各结构蛋白转录本在感染后的变化  42-44
    3.1.9 IFA 分析 9a5b 病毒各结构蛋白在细胞中的定位情况  44
    3.1.10 荧光染色分析 9a5b 病毒感染细胞后细胞骨架的定位情况  44
  3.2 结果  44-51
    3.2.1 9a5b 病毒在 DF-1 细胞中的一步生长曲线  44-45
    3.2.2 Western-blot 检测 9a5b 病毒感染 DF-1 后结构蛋白变化情况  45
    3.2.3 Real-time RT-PCR 检测 9a5b 病毒各结构蛋白转录本在感染后的变化  45-47
    3.2.4 IFA 分析 9a5b 病毒各结构蛋白在细胞中的定位情况  47
    3.2.5 荧光染色分析 9a5b 感染 DF-1 后细胞蛋白动态变化  47-50
    3.2.6 P蛋白与细胞骨架的共染色结果  50-51
    3.2.7 可见光观察 9a5b 感染 DF-1 后细胞形态变化  51
  3.3 讨论  51-54
    3.3.1 各结构蛋白转录本的动态变化  52
    3.3.2 各结构蛋白量及在细胞中的蛋白定位变化  52-53
    3.3.3 细胞蛋白动态变化  53-54
第四章 CLASSⅠNDV感染CEF蛋白组学初步研究  54-61
  4.1 材料和方法  54-57
    4.1.1 病毒  54
    4.1.2 实验动物及细胞  54
    4.1.3 主要试剂  54
    4.1.4 主要仪器  54
    4.1.5 主要缓冲液及试剂配制  54-55
    4.1.6 制备细胞样品及蛋白BCA定量  55
    4.1.8 二维电泳  55-56
    4.1.9 质谱分析及数据库检索  56-57
  4.2 结果  57-61
    4.2.1 双向电泳蛋白分离以及图像分析结果  57
    4.2.2 质谱分析结果  57-58
    4.2.3 讨论  58-61
第五章全文结论  61-62
参考文献  62-67
致谢  67-68
作者简历  68

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