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应用DF-1细胞和激流式生物反应器大规模增殖IBDV的研究

作　者: 王永生
导　师: 陈陆；王川庆；王泽霖
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: IBDV DF-1细胞 激流式生物反应器
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


鸡传染性法氏囊病是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性高度接触性传染病。目前,该病主要通过疫苗接种来防控。除给雏鸡使用活疫苗免疫外,通常还给种鸡注射灭活疫苗使雏鸡获得高的母源抗体,以保护其在生命早期不感染传染性法氏囊病病毒。国内鸡传染性法氏囊病灭活疫苗的生产通常采用鸡胚成纤维细胞培养病毒液后制备而成。因鸡传染性法氏囊病毒在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度不高,需要加大浓缩倍数,增加生产成本,免疫效果差,所以在实践中应用效果差。目前,国内各大种鸡场大多采用进口灭活疫苗。为了研究鸡传染性法氏囊病毒高效培养方法,本研究采用鸡胚源DF-1细胞系代替传统的鸡胚成纤维细胞,用激流式生物反应器纸片载体代替传通的玻璃转瓶培养鸡传染性法氏囊病毒,为生产上提供一种优质、高效的法氏囊灭活疫苗,以满足市场的需要。研究结果如下:1.通过对DF-1细胞传代、复苏及冻存方法、培养条件等特性进行研究,确定了DF-1细胞的最佳培养条件。DF-1细胞可在37℃条件下培养,培养基为DMEM/F12,生长期的培养基中加入10%的胎牛血清最好,细胞复苏时应采用换液而不能采取离心的方法。2.通过在方瓶中对鸡传染性法氏囊病毒HQ株在DF-1细胞上的适应及增殖条件进行优化,结果表明,鸡传染性法氏囊病毒HQ毒在DF-1细胞上具有很好的适应性,而在Vero细胞上适应性差。鸡传染性法氏囊病毒在DF-1细胞上增殖的最佳pH为7.0,最佳维持液血清含量为2%,最佳接毒时间为细胞传代后72h,最佳接毒量的MOI为0.8 (TCID50/细胞),最佳收毒时间为接种后36h。这为IBDV在生物反应器大规模培养技术的研究提供了参考依据。3.对应用AP10和AP20激流式生物反应器和纸片载体增殖IBDV的条件进行优化,试验结果表明,反应器中IBDV增殖的最适pH为7.0-7.2,37℃最适合细胞与病毒的增殖,AP10激流式生物反应器最佳的细胞接种数量为3×109个,MOI为0.9(TCID50/细胞),当细胞的糖耗下降至接近零时为最佳收病毒时间, IBDV在反应器中的毒价可达到109.5TCID50·mL-1。本研究在国内首次采用DF-1细胞系代替鸡胚或其原代成纤维细胞培养IBDV,并首次采用激流式生物反应器和纸片载体代替转瓶大量增殖DF-1细胞进行IBDV的大规模培养,使IBDV的毒价由在转瓶成纤维细胞上培养时的107.5TCID50·mL-1上升至目前的109.5TCID50·mL-1,提高了100倍。本研究为IBDV灭活疫苗和其他生物制品的大规模生产开辟了一条新途径,不仅大大提高了疫苗的质量,降低了生产成本,而且更符合现代生物制品行业发展的生物安全需要,因而具有重大的理论意义和实用价值,具有更有广阔的应用前景。

全文目录


致谢  4-7摘要  7-8文献综述  8-20  1 鸡传染性法氏囊病毒的发现  8  2 传染性法氏囊病毒的生物学及分子特征  8-9  3 传染性法氏囊病毒的流行病学  9-10  4 传染性法氏囊病疫苗的研究进展  10-13    4.1 传统疫苗  10-11    4.2 抗原-抗体复合物疫苗  11    4.3 基因工程疫苗  11-13  5 动物细胞大规模培养技术的研究进展  13-20    5.1 动物细胞培养的起源  13    5.2 动物细胞培养的方法  13-14    5.3 动物细胞的大规模培养技术  14-17    5.4 安普激流灌注式生物反应器的应用  17-20试验一 鸡胚源 DF-1 细胞系的培养特性研究  20-26  1 材料与方法  20-22    1.1 材料  20      1.1.1 主要仪器  20      1.1.2 主要材料  20      1.1.3 细胞  20    1.2 方法  20-22      1.2.1 DF-1 细胞的传代  20-21      1.2.2 DF-1 细胞的冻存及复苏  21      1.2.3 DF-1 细胞培养条件的优化  21-22  2 结果  22-24    2.1 DF-1 细胞的传代  22    2.2 DF-1 细胞的冻存与复苏方法的比较  22-23    2.3 不同培养基对DF-1 细胞生长的影响  23    2.4 不同温度对DF-1 细胞生长的影响  23    2.5 DF-1 细胞生长曲线的确定  23-24  3 讨论  24-26试验二 IBDV 在 DF-1 细胞系上的增殖特性研究  26-40  1 材料与方法  26-29    1.1 材料  26      1.1.1 主要仪器  26      1.1.2 主要材料  26      1.1.3 细胞与种毒  26    1.2 方法  26-28      1.2.1 IBDV 种毒的繁殖  26-27      1.2.2 IBDV 在DF-1 细胞和Vero 细胞上培养的适应性比较  27      1.2.3 IBDV 在DF-1 细胞上的最佳增殖条件的确定  27-28    1.3 毒价测定方法  28-29  2 结果  29-37    2.1 IBDV 在DF-1 细胞和Vero 细胞上的适应性比较  29-30    2.2 方瓶中IBDV 的最佳接毒量及最佳收毒时间的确定  30-31    2.3 IBDV 增殖的最佳pH 的确定  31-34    2.4 不同接毒时间对IBDV 增殖的影响  34-35    2.5 血清浓度对IBDV 增殖的影响  35-36    2.6 方瓶培养 IBDV 时上清液与细胞全悬液毒价之间的关系  36    2.7 病毒增殖的糖耗曲线的确定  36-37    2.8 转瓶中接毒量和收毒时间的确定  37  3 讨论  37-40试验三 IBDV 在激流式生物反应器上大规模增殖的研究  40-54  1 材料与方法  40-43    1.1 材料  40      1.1.1 主要仪器  40      1.1.2 主要材料  40      1.1.3 细胞与病毒种毒  40    1.2 方法  40-43      1.2.1 转管中IBDV 增殖条件的优化  40-41      1.2.2 AP10 及AP20 生物反应器增殖IBDV 的工艺流程  41-42      1.2.3 激流式生物反应器中 IBDV 增殖条件的初步确定  42-43  2 结果  43-51    2.1 转管中IBDV 增殖条件的优化  43-45    2.2 激流式生物反应器中IBDV 增殖条件的初步确定  45-51  3 讨论  51-54参考文献  54-58英文摘要  58-59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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