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传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征、表达与应用

作　者: 欧阳伟
导　师: 张海彬；王永山
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 传染性法氏囊病 IBDV VP2基因分子特征杆状病毒昆虫细胞间接ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的以侵害雏鸡淋巴组织,特别是中枢免疫器官—法氏囊为主要特征的传染病。该病不仅引起患病动物死亡,而且还导致机体免疫抑制,使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败,对易感鸡群实施疫苗接种是预防该病最有效的方法,但由于各地流行的IBDV毒株的毒力与抗原性的差异,给疫苗毒株的选择造成较大的困难,每年由于IBD免疫失败或免疫抑制造成的经济损失巨大。为了抵抗超强毒的攻击以及母源抗体的干扰,目前广泛应用中等毒力的IBD活疫苗,给IBD的防控带来极大的隐患,灭活疫苗存在着抗原制备的困难。鉴于此,进一步分析当前IBDV的分子流行病学、研制新型的基因工程疫苗,仍是当前禽病防控工作中亟待解决的重要课题。本文对近期流行毒株IBDV的主要保护性抗原VP2基因的分子特征进行了分析,利用杆状病毒表达系统表达了重组VP2蛋白,并进行了初步应用研究,为IBDV的诊断和防控提供了科学依据和技术支持。研究内容包括三个部分：实验1：近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征用RT-PCR方法从2007年12月在安徽境内发生的两起传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织AH1与AH2中扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1350nt,编码450aa,七肽基序均为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征,用AH1和AH2感染20日龄雏鸡,产生明显IBD病变,死亡率为25%(1／4)。同源性分析,26个血清Ⅰ型IBDV毒株VP2基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为90.7%-99.6%和95.5%-100.0%,其中,15个中国IBDV毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在97.5%-99.7%、98.6%-100.0%,血清Ⅰ和Ⅱ型IBDV毒株之间核苷酸和氨基酸序列的同源性则分别小于78.6%和83.0%。不同IBDV毒株VP2基因的七肽基序、特征性氨基酸残基以及高变区的亲水性有差异。在进化树上,26个血清Ⅰ型IIBDV毒株可分为数组,其中的15个中国分离IBDV毒株不在同组,毒株之间的亲缘关系与分离地区或分离时间没有明显的联系。AH1和AH2与现行商品疫苗毒株B87的VP2基因核苷酸序列差异率分别为5.3%和5.2%；氨基酸序列差异率分别为4.0%和3.4%,这也进一步佐证了IBDV野毒VP2基因变异所引起的毒力变化和VP2抗原表位的漂移是导致当前IBD疫苗免疫预防失败的主要原因。本文对认识当前IBDV的流行和变异现状具有参考价值,为新型IBDV野毒致病性和变异简便定性检测方法探索了一条新途径。实验2：传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达将2007年12月从安徽境内发生的IBD免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中克隆的IBDV VP2基因插入到pFastBacl供体质粒中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选,获得重组杆状病毒表达质粒rBac-VP2,用脂质体法转染Sf9细胞。对rBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光；用免疫印迹(Western-blotting)分析,在50kD处出现一条特异蛋白条带；电镜观察,重组VP2蛋白能够自组装成病毒样颗粒。本实验为研制针对近期流行IBDV的新型病毒样颗粒疫苗和新型检测试剂奠定了基础。实验3：传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的融合表达与应用将2007年12月从安徽境内发生的IBD免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中克隆的BDV VP2基因定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化E.coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒rBacA-VP2。用rBacA-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。对重组杆状病毒感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光；用BDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应,抗原效价达到102；用免疫印迹(Western-blotting)分析,在53kD处出现一条特异蛋白条带；电镜观察,重组VP2蛋白能够自组装成病毒样颗粒。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组VP2蛋白作为包被抗原,建立了IBDV抗体间接ELISA检测方法。本研究为进一步研究IBD新型病毒样颗粒疫苗和抗体检测试剂奠定了基础。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
缩略语表  12-13
第一篇文献综述  13-28
  第一章传染性法氏囊病的防控技术研究进展  13-28
    1. IBDV概述  13-16
    2. IBDV分子生物学方面的研究  16-20
      2.1 基因组结构  16-17
      2.2 病毒蛋白及其作用  17-19
      2.3 抗原变异的分子水平研究  19-20
    3. IBD的防控  20-26
      3.1 IBD诊断  20-21
      3.2 IBD预防  21-22
      3.3 IBD基因工程疫苗的研究  22-26
    参考文献  26-28
第二篇试验研究  28-61
  第二章近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征  28-39
    1. 材料与方法  29-30
    2. 结果  30-34
    3. 讨论  34-35
    参考文献  35-38
    英文摘要  38-39
  第三章传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达  39-49
    1. 材料与方法  40-42
    2. 结果  42-45
    3. 讨论  45-46
    参考文献  46-48
    英文摘要  48-49
  第四章传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的融合表达与应用  49-61
    1. 材料与方法  50-53
    2. 结果  53-56
    3. 讨论  56-58
    参考文献  58-60
    英文摘要  60-61
全文总结  61-62
附录:常用试剂的配制  62-66
致谢  66-67
攻读学位期间发表的学术论文目录  67

传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征、表达与应用

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