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副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法建立及其分离株高密度发酵研究

作　者: 苗立中
导　师: 韩文瑜; 沈志强
学　校: 吉林大学
专　业: 兽医
关键词: 副猪嗜血杆菌荧光定量PCR 分离鉴定高密度发酵
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)感染引起的疾病，又被称为猪革拉泽氏病。近年来随着世界规模化养猪业的发展，该病已成为严重影响养猪业的新发细菌病之一，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。本研究分离鉴定2株副猪嗜血杆菌；建立了副猪嗜血杆菌实时荧光定量PCR检测方法并应用于临床；优了化副猪嗜血杆菌大规模高密度发酵工艺并应用于生产。为我国的副猪嗜血杆菌病的临床诊断、病原检测、疫苗抗原生产打下基础，其主要研究内容如下。1.疑似副猪嗜血杆菌分离培养及鉴定从浙江和河南疑似副猪嗜血杆菌病猪的病变组织中分离到2株细菌，对其进行形态观察、生化特性等常规性鉴定，同时进行了PCR鉴定（根据HPS16S rRNA基因设计的特异性引物），并将扩增片段测序，测序结果与已知副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因序列进行比对分析。生化试验结果为蔗糖、接触酶、半乳糖和果糖等阳性，D-甘露醇、H2S、氧化酶和D-山梨醇阴性，生长需要NAD。浙江株和新乡株16S rRNA序列与已发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA序列同源性最高分别为100%和99%，因此鉴定该分离菌株为副猪嗜血杆菌。2.副猪嗜血杆菌实荧光定量PCR方法建立及应用建立了基于SYBR Green I的快速检测副猪嗜血杆菌（HPS）的实时荧光定量PCR方法。参照GenBank公布的HPS的infB基因序列（DQ:781933.1），设计特异性引物；提取HPS基因组，进行PCR扩增，回收目的片段；构建阳性标准模板，建立标准曲线；验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示，本试验得到了阳性标准质粒，并建立了标准曲线，其线性关系良好，在10~2~10~8copies/μL检测范围内；该方法敏感性达到10copies/μL，比常规PCR高100倍，重复性试验变异系数均小于2.5%，同时对HPS具有良好的特异性。结果表明，本研究所建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。3.副猪嗜血杆菌分离菌株大规模高密度发酵培养工艺优化及应用以副猪嗜血杆菌浙江分离株ZJ-1株为研究对象，通过单因素试验和正交试验进行副猪嗜血杆菌液体培养基配方的优化，单因素试验结果表明：选用蔗糖作为副猪嗜血杆菌培养的初始碳源，初始蔗糖浓度应为5g/L；蛋白胨、酵母粉、胰酪胨及大豆胨在副猪嗜血杆菌发酵培养基中的最佳添加量分别为4g/L、2g/L、4g/L及3g/L；在副猪嗜血杆菌培养基中应添加2g/L的硫酸铵；向副猪嗜血杆菌培养基中添加5%的马血清时，菌体浓度及活菌数目最高，分别为0.671、1.8x108cfu/ml；选取辅酶的添加浓度为0.005%；正交试验实验结果表明：当选取蔗糖2g/L；酵母粉2g/L；硫酸铵2g/L；马血清5%时菌体密度及活菌数目最高。高密度发酵条件优化结果：温度为37℃、溶氧水平维持在10%、培养基pH值为7.2、补料方式为恒葡萄糖浓度时ZJ-1株菌体密度及活菌数目达到最高，分别为16.8、3.6x10~9cfu/ml。利用优化配方和优化发酵工艺，在GMP生产车间大规模试生产3批次副猪嗜血杆菌半成品抗原，效果良好。因此本研究为大批量高密度发酵生产副猪嗜血杆菌抗原提供了试验依据。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
英文缩写词表  11-13
前言  13-14
第一篇文献综述  14-26
  第一章副猪嗜血杆菌病原学研究进展  14-19
    1 副猪嗜血杆菌的生物学特点  14
    2 副猪嗜血杆菌的分离与培养  14-15
    3 副猪嗜血杆菌的分型研究  15
    4 副猪嗜血杆菌毒力相关因子  15-17
    5 基因结构和基因表达  17-19
  第二章副猪嗜血杆菌诊断方法研究进展  19-23
    1 病原学检测技术  19
    2 血清学检测技术  19-20
    3 分子生物学检测技术  20-23
  第三章高密度发酵培养研究进展  23-26
    1 营养源  23
    2 代谢产物  23
    3 溶氧浓度  23
    4 温度  23-24
    5 pH 值  24
    总结与展望  24-26
第二篇研究内容  26-64
  第一章副猪嗜血杆菌分离培养及鉴定  26-37
    1 材料与方法  26-30
    2 结果与分析  30-35
    3 小结  35-37
  第二章荧光定量 PCR 快速检测副猪嗜血杆菌方法的建立及应用  37-51
    1 材料与方法  37-43
    2 结果与分析  43-49
    3 小结  49-51
  第三章副猪嗜血杆菌大规模高密度发酵培养工艺优化及应用  51-64
    1 材料与方法  51-53
    2 结果与分析  53-63
    3 小结  63-64
结论  64-65
参考文献  65-73
导师简介  73-74
作者简介  74-76
后记与致谢  76

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法建立及其分离株高密度发酵研究

内容摘要

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