学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

利用基因工程手段提高两种微藻的生物量与特定代谢产物产量

作　者: 闫晋飞
导　师: 游松
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 乙酰辅酶A合成酶裂壶藻电击转化法微藻DHA 高密度发酵雨生红球藻农杆菌转化法基因枪法转录水平调控外源蛋白基因(GLUT-1,VHB) 虾青素
分类号: R915
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 84次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

用基因工程手段提高裂壶藻生长速度和脂肪酸含量裂壶藻(Schizochytrium sp.)又称裂殖壶菌,属不等鞭毛门(Stramenopiles),是一种异养微藻。裂壶藻合成丰富的多不饱和脂肪酸,其二十碳五烯酸(timnodonic acid, DPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)占总脂肪酸60%以上,占细胞干重的43%,是用于工业发酵生产长链多不饱和脂肪酸的几种非常理想的异养真核微藻之一。目前,利用裂壶藻生产长链多不饱和脂肪酸面临的主要问题之一是在高密度发酵过程中,葡萄糖转化后积累出的乙酸会对发酵过程微生物产生负面影响。为解决这一难题,我们拟通过电击转化法将大肠杆菌中的乙酰辅酶A合成酶基因(acetyl-coA synthetase,ACS)引入到海洋裂壶藻Schizochytrium sp. TIO1101中。对转化子进行PCR、Southern和Western免疫印迹检测的结果显示：外源ACS基因转化成功并在传代过程中稳定表达。摇瓶培养及高密度发酵实验的检测结果显示：外}源ACS基因表达可以降低培养基醋酸浓度,增加细胞内乙酰辅酶A库存,显著提高生物量和脂肪酸含量。以上结果表明,过表达ACS促进了裂壶藻三羧酸循环方向的代谢,降低了乙酸的积累,能显著提升DHA的产量。证明引入的ACS对改善裂壶藻代谢方面确实有重要意义。雨生红球藻遗传转化研究雨生红球藻Haematococcus pluvialis)是一种单细胞绿藻,新形成细胞体积较小,呈球形或卵圆形,黄绿色,有两根鞭毛。雨生红球藻则是属于绿藻门(Chlorophata),绿藻纲(Chlorophyceae),团藻目(Volvocales),红球藻科Haematococcaceae),红球藻属(Haematococcus)。微藻是天然虾青素重要的来源之一。微藻中虾青素含量最高的是雨生红球藻,也是所有已知能积累虾青素生物体中合成量最高的物种,其合成量最高可达细胞干重的4%。在转基因裂壶藻的基础上,结合以前的经验教训,分别用农杆菌侵染法和基因枪法对雨生红球藻做了外源基因稳定表达的实验尝试。同时从启动子,报告基因,抗性筛选基因和目的基因的组合方面进行考虑,构建了多个质粒。通过荧光标记验证,抗性筛选,PCR鉴定,结果证明农杆菌侵染法和基因枪法均可将外源基因导入雨生红球藻。由于雨生红球藻自身的生物特性及实验设计的复杂程度,未来将对外源蛋白的定位,功能性验证等方面进行深入研究,并将是实验室未来的一个长期的研究方向。

全文目录

摘要  11-13
Abstract  13-15
缩略词  15-16
第一部分用基因工程手段提高裂壶藻生长速度和脂肪酸含量  16-68
  第一章绪论  16-34
    1.1 裂壶藻  16
    1.2 裂壶藻生产二十二碳六烯酸(DHA)  16-30
      1.2.1 DHA性质  16-17
      1.2.2 DHA生理功能  17-20
      1.2.3 DHA的应用  20-22
      1.2.4 DHA来源  22
      1.2.5 DHA替代资源  22-24
      1.2.6 DHA的合成途径  24-27
      1.2.7 用裂壶藻生产DHA的进展、优势、产量和安全性  27-29
      1.2.8 培养裂壶藻生产DHA的影响因素  29-30
    1.3 微藻的转基因研究  30-32
    1.4 本研究的目的和意义  32-34
  第二章材料与方法  34-48
    2.1 实验材料  34-37
      2.1.1 藻种和细胞株  34
      2.1.2 质粒  34
      2.1.3 仪器与试剂  34-37
    2.2 试验方法  37-46
      2.2.1 研究的技术路线  37
      2.2.2 同源重组质粒构建  37-40
      2.2.3 电穿孔遗传转化裂壶藻  40
      2.2.4 基因整合的PCR检测  40-41
      2.2.5 Southern Blot检测  41
      2.2.6 半定量逆转录PCR(RT-PCR)分析  41
      2.2.7 蛋白提取、含量分析  41
      2.2.8 Western杂交检测  41-42
      2.2.9 葡萄糖和醋酸盐分析  42-44
      2.2.10 生物量和脂肪含量,DHA含量分析  44-46
    2.3 裂壶藻发酵罐培养  46-48
      2.3.1 发酵罐(5L)放大培养  47
      2.3.2 裂壶藻生物量测定  47
      2.3.3 总脂提取与DHA含量测定  47-48
  第三章结果与分析  48-64
    3.1 质粒构建  48-56
    3.2 外源(大肠杆菌ACS)基因导入裂壶藻的研究  56-58
    3.3 过表达ACS基因裂壶藻的生物学效应  58-59
    3.4 过表达大肠杆菌ACS基因裂壶藻转化子生物量和脂肪酸组成  59-61
    3.5 发酵罐培养结果  61-64
  第四章讨论  64-68
    4.1 转基因裂壶藻研究  64-65
    4.2 利用转基因裂壶藻生产DHA的研究  65-66
    4.3 结论与展望  66-68
第二部分雨生红球藻遗传转化研究  68-108
  第五章绪论  68-80
    5.1 雨生红球藻  68-69
    5.2 雨生红球藻生产虾青素  69-77
      5.2.1 虾青素的性质  69-70
      5.2.2 虾青素的生理功能  70-72
      5.2.3 虾青素的应用  72-73
      5.2.4 天然虾青素安全性  73-74
      5.2.5 虾青素的不同来源  74-76
      5.2.6 利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展  76-77
    5.3 雨生红球藻转基因研究  77
    5.4 本研究的目的和意义  77-80
  第六章材料与方法  80-92
    6.1 实验材料  80
    6.2 仪器与试剂  80
    6.3 实验方法  80-92
      6.3.1 载体构建所用引物  80-82
      6.3.2 p3300Zeo/EGFP质粒构建  82-83
      6.3.3 p3300Zeo/Glut1/VHB构建  83-85
      6.3.4 pSV40Glut1/35sVHB/ubiBar质粒构建  85-87
      6.3.5 雨生红球藻藻种(株)及培养  87-88
      6.3.6 农杆菌介导的雨生红球藻转化  88-89
      6.3.7 雨生红球藻基因枪转化  89-90
      6.3.8 转化子鉴定  90-92
  第七章结果与讨论  92-108
    7.1 P3300ZEo/EGFP构建  92-95
    7.2 P3300ZEo/GLUT1/VHB构建  95-99
    7.3 PSV40GLUT1/35sVHB/UBIBAR质粒构建  99-104
    7.4 转化子的鉴定  104-105
      7.4.1 农杆菌介导法转化子的鉴定  104-105
      7.4.2 基因枪法转化子的鉴定  105
    7.5 讨论  105-106
    7.6 展望  106-108
参考文献  108-122
致谢  122-124
附录  124-125
附件  125-131

利用基因工程手段提高两种微藻的生物量与特定代谢产物产量

内容摘要

全文目录

相似论文